特发性男性不育症家系的细胞力学、蛋白质组学以及基因组学研究

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1、分类号：R711.6密级：公开研究生学位论文特发性男性不育症家系的细胞力学、蛋白质论文题目（中文）组学以及基因组学研究Mechanicalpropertiesmeasurement,proteomicandgenomicstudiesofidiopathic论文题目（外文）maleinfertilityonaChineseconsanguineousfamily研究生姓名马莹学科、专业生物学·遗传学生殖遗传学研究方向学位级别博士导师姓名、职称谢小冬教授张振昶副教授论文工作起止年月2014年9月至2018年9月论文提交日期2018年11月论文答辩日期2

2、018年12月学位授予日期2018年12月校址：甘肃省兰州特发性男性不育症家系的细胞力学、蛋白质组学以及基因组学研究中文摘要研究背景据调查全世界大约8％的育龄男性存在生育障碍，男性不育患者至少达到2000万。男性不育的病因是多方面的，已知的原因包括：先天性或获得性泌尿生殖系统异常，恶性肿瘤，泌尿生殖道感染，阴囊温度升高，内分泌紊乱，免疫因素和一些特征性的遗传异常。但仍有大约40%的男性不育患者的病因尚不明确。尽管辅助生殖技术为不孕不育患者带来了福音，但大约有一半的夫妇即使经过多次治疗仍未能成功怀孕。因此研究不育症的分子机制将有助于将来不育症的精确诊断

3、和精准治疗。第一部分畸形精子的细胞力学研究目的：以特发性不育症家系患者的精子作为研究对象，用原子力显微镜研究精子头部的力学特征以及力学特征和染色质凝集的关系。方法：收集不育症家系病患的精液标本和正常生育能力的志愿者的精液标本。采用上游法分离精子。使用原子力显微镜观察单个无定型头畸形精子和单个正常精子的活体形貌，精子表面粗糙度，并表征单个精子的物理学特性。对比分析正常形态精子和头部畸形精子之间的形貌差异以及物理学特性的差异。分析精子物理学特性和染色质凝集之间的关系。采用苯胺蓝染色、精子染色质结构试验(spermchromatinstructureass

4、ay,SCSA)、免疫印迹法以及透射电镜来检测精子染色质凝集状态。结果：发现头部畸形精子的表面形貌，物理学特性，染色质凝集状态与正常形态精子显著不同。头部畸形精子的长、宽、高均大于正常精子。顶体后区长度也大于正常精子。头部畸形精子的表面粗糙度大于正常精子（343.21±94.71nmvs.232.10±49.65nm（P<0.0001），刚度小于正常精子（3.54±0.52vs.4.25±1.39;P<0.001）。苯胺蓝染色和免疫印迹法结果均提示畸形精子的组蛋白没有完全被I鱼精蛋白替换。SCSA结果显示与正常精子相比畸形精子呈现高DNA可染率（hi

5、ghDNAstainability,HDS）(26.95±2.75%vs.9.40±2.87%;P<0.001)，和高精子DNA碎片率(DNAfragmentationindex,DFI)(45.69±2.15%vs.8.02±2.57%;P<0.001)。透射电镜超微结构观察显示精子染色质结构松散。Pearson检验发现精子核区刚度和染色质凝集程度呈正相关。结论：精子的物理学特征可以作为评价精子质量的新指标。本研究首次采用物理学方法来研究精子，为进一步了解畸形精子症做出了贡献。第二部分特发性男性不育症家系的蛋白组学研究目的：以不育症家系病患的精子和

6、正常精子为研究对象，通过双向电泳和MALDI-TOF-MS技术研究病患精子和正常精子的差异蛋白图谱，探讨畸精不育的分子机制。方法：收集不育症家系病患的精液标本和40例生育力正常的志愿者的精液标本。采用密度梯度离心分离精子，尿素/硫脲法提取精子蛋白。2-DE分离差异蛋白，银染后用PDQuest8.0软件分析比较病患精子和正常精子的电泳图谱，寻找差异蛋白点。对差异蛋白点行MALDI-TOF-MS分析，将获得的肽质量指纹谱（PMF）进行数据库搜索和生物信息学分析。利用DAVID软件对差异蛋白行功能聚类分析，利用STRING软件预测差异蛋白间相互作用。结果：

7、本实验获得清晰且重复性好的异常精子组和正常精子组的双向凝胶电泳图谱。两组的2-DE图谱中有26个点发生明显变化，其中12个上调，14个下调。将26个蛋白点进行质谱鉴定成功鉴定了26个蛋白。其中在特发性男性不育症家系患者中表达上调的蛋白质：Semenogelin-1、Semenogelin-2、SEMG2protein。其中表达下调的蛋白质：ropporin-1Aisoforma、clusterinpreproprotein、ASRGL1protein、GlutathioneS-transferaseMu3、Tubulinalpha-3Echain、T

8、ubulinbeta-4Bchain、Succinate--CoAligase[ADP-forming]su