继代次数对草地早熟禾愈伤组织内源激素水平和DNA变异的影响

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1、摘要为了探索继代次数对草地早熟禾愈伤组织内源激素水平和DNA变异的影响以及愈伤组织分化能力与内源激素水平之间的关系。本研究以草地早熟禾品种‘纳苏’为材料，取地下根茎上的芽(茎芽)为外植体，通过在N6基本培养基中附加不同浓度的2，4．D、6．BA和NAA研究了草地早熟禾茎芽愈伤组织再生体系的建立。在此基础上，利用酶联免疫吸附法研究了不同继代次数愈伤组织的内源激素水平，利用AFLP分子标记技术分析了继代次数对愈伤组织DNA变异的影响。主要结果如下：以N6为基本培养基，愈伤组织诱导的适宜植物生长调节剂水平是2,4-D2．0mgoL。+

2、6-BA0．2mgoL-1；愈伤组织继代培养的适宜植物生长调节剂水平是2,4-D1．0mg·L1-I-6-BA0．5mg·L1；愈伤组织分化的适宜植物生长调节剂水平是6-BAI．0mg．L1+KT0．5mg·L‘：不定芽长到l-2cm时转接到无生长调节剂的MS培养基中进行生根和壮苗培养，30d左右即可长成根系发达的健壮植株，移栽成活率达到100％。同时发现继代次数对愈伤组织的分化率有明显影响，继代2次后开始分化，随着继代次数的增加，其分化率逐渐升高，继代5到6次的愈伤组织分化率最高，之后随着继代次数的增加，分化率逐渐降低。草地早

3、熟禾愈伤组织中IAA和ABA含量在其继代1到4次时，其含量逐渐升高，继代5次达最大值，之后，又逐渐降低，继代后愈伤组织分化率也呈先升高再降低的变化趋势，继代5次的愈伤组织分化率最高，表明内源IAA和ABA含量上升到或维持在较高水平对愈伤组织的分化有促进作用；GA含量的在继代1次时较高，之后逐渐降低，继代4到6次时始终保持在较低水平，之后又逐渐升高，表明内源GA的含量对愈伤组织的分化可能有阻碍作用；ZR的含量随着继代次数的增加而增加，与愈伤组织分化没有明显的相关性。继代3次的愈伤组织在AFLP电泳图谱上反映出高频率的谱带缺失，与继

4、代1次相比，缺失了550条带，增加了73条带；继代5、7、9、11次的愈伤组织，检出片段的多态性比率分别为40．57％、49．73％、50．88％、53．74％，与继代1次相比，其增加和缺失的多态性片段总和分别为501条、500条、521条、699条，表明随着继代次数的增加，愈伤组织的变异逐渐增多，继代3次是草地早熟禾愈伤组织变异的高发期：通过比较不同继代次数间愈伤组织DNA水平的变异，发现继代3次与继代1次相比，有623条多态性带，7次与5次相比，9次与7次相比、11次与9次相比，其多态性带分别为617条、597条、523条、

5、494条，表明随着继代次数的增加，变异逐渐趋于平缓。由此可以推测出，在草地早熟禾组织培养过程中，如果进行种子资源保存或遗传转化，可将愈伤组织的继代次数控制在5到9次，以减少愈伤组织阶段的变异，进而获得遗传稳定性高的再生植株：如果要更好的利用组织培养过程中产生的体细胞变异进行新品种的培育，可将愈伤组织继代次数控制在3到5次或9次以上，以利用愈伤组织阶段的变异，进而获得遗传变异范围广的再生植株；在草地早熟禾体细胞诱变育种的研究中，考虑到愈伤组织的变异率和分化率之间的平衡，可将愈伤组织继代次数确定在5到9次，进而获得有价值的突变体。√

6、圩LP方法一次可同时鉴定多种变异类型，是鉴定草地早熟禾愈伤组织体细胞变异的灵敏、可靠、有效方法。关键词：草地早熟禾；愈伤组织；继代次数；DNA变异；内源激素ⅡAbstractInthispaper,tostlldytheeffectofsubculturetimesOUendogenoushormoneandDNAvariationinKentuckybluegrasstissuesubcultureandaswellastherelationshipbetweencallusdifferentiationcapacityand

7、endogenoushormone，therhizomebudsofKentuckybluegrass(PoapratenMsL．)‘nassu’werecultivatedonN6meAliulncontainingdifferentlevelsof2，4．D、6-BAandNAA．Andtheregenerationsystemfi'omrhizomebudsofKentuckybluegrassWasdeveloped．Additionally,basedontheabovementionedresearch,Wealso

8、studiedthechangesofendogenoushormonesviaELISAandgenomeDNAvariationviaAFLPofKentuckybluegrasscallusafterdifferenttin：1cSofsubculture