获取基因全长cDNA策略及应用

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1、第29卷第2期健康研究V01．29NO．22009年4月HealthResearchApr．2009获取基因全长eDNA策略及应用邵珏，邵玉锁，曹明富(杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州310036)摘要：全长cDNA是研究基因功能的关键，获得全长cDNA也是基因组研究的重要内容之一，本文概述了近年来国内外获取未知基因eDNA全长的理论及其应用。关键词：全长eDNA；mRNA；PCR；进展中图分类号：Q73文献标识码：A文章编号：1008—4894(2009)02—0140—03模式植物结构基因组的相继阐明，多种植物了拟南芥雄性不育基因BnMs2；Pan等分离到了高密度分子标记连锁图谱的构

2、建、大片段DNA克一个新的水稻细胞色素P450基因CYP81A6，这个隆系统的建立，序列测定技术和基因遗传转化技基因对2种除草剂具有抗性；Paul等在拟南芥中术的发展，使得更多未知基因的克隆成为可能，同分离到了与拟南芥根尖铝元素运输和敖合相关的基时也为后基因组时代提供了更富有挑战性的任因ALS1—1。务。不论功能基因组学多么深奥，其认识基因功能的基本前提是获取可能有相关功能的基因之全2转座子或T·DNA标签法(transposonorT-DNA长编码序列。其中，全长cDNA序列的获取是正确taggingmethod)地注释基因组序列、进行基因的功能及产物分析此法的基本程序为：首先进行突变体的

3、诱变和的必要前提。本文就获取基因全长cDNA策略及鉴定工作，然后以转座子或T-DNA作为标签DNA应用进行综述。制成探针或引物，筛选突变体基因组文库，用反义PCR(IPCR)技术分离出标签DNA两侧目的基因部1图位克隆技术(map-basecloningorpositional分序列，再依据序列设计探针或引物筛选野生型基cloning)因组文库，即可分离出完整的基因，最后用基因互补其基本工作思路为：首先将目的基因精确定位测验检测其功能。现在又发展了一种转座子捕捉在分子标记连锁图上，利用与目的基因紧密连锁的(transposontraps)的手段来捕捉那些无表型突变的标记筛选大片段DNA文库(

4、如YAC、BAC、TAC、基因，包括有增强子捕捉和基因捕捉两种类型。在PAC或cosmid文库)，并构建含目的基因区域的精植物中利用的转座子系统有Ae／Ds、Mutator等，其细物理图谱，利用该物理图谱采用染色体步行中以Ac／Ds双因子系统利用最多。目前应用该方(chromosomewalking)的方法逐步逼近目的基因。法已克隆到的植物抗病基因有玉米抗圆斑病基因图位克隆法首先被应用于模式植物拟南芥(Arobi-Hml，Hm2，番茄抗叶霉病基因Cf-2，Cf-4，Cf-5，Cf-9dopsisthaliana)。应用该方法，傅廷栋等¨成功分离及Cf．ECP2等。黄海宁等应用转座子标签法收稿

5、日期：2008—12—19作者简介：邵珏(1983一)，女，浙江杭州人，硕士研究生，专业：遗传学。通信作者：曹明富(1955一)，男，浙江海宁人，教授，博士生导师，研究领域：细胞生物学与毒理遗传学。第2期邵珏，等：获取基因全长cDNA策略及应用141克隆了对阴沟肠杆菌B8中与抗水稻白叶枯病菌拮面：一是基因表达种类的不同，二是基因表达水平的抗活性相关的DNA片段。不同。差异表达基因克隆技术一般需要两种或两种以上不同的组织群体，其中一种或几种是目的基因3同源序列法(homology-basedcandidategene不表达或异常表达([+])，而另一种是目的基因正method)常表达([一])

6、，然后制备两种不同的mRNA，反转其基本思路分为两种：①根据基因家族各成员录PCR并制备两种cDNA探针，分别与表达目的基间保守氨基酸序列设计简并引物，并用简并引物对因的cDNA文库进行杂交筛选，选出只与[+]探针含有目的基因的DNA文库进行PCR扩增，再对杂交而不与[一]探针杂交的克隆，或与[+]探针高PCR扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。②生物度杂交而与[一]探针杂交信号很弱的克隆，从而检的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区测出特异表达的克隆，并进行后续的分子生物学功的序列，基于此原理，在其它种属同源基因被克隆的能研究。郭宾会等利用DDRT-PCR(mRNA差前提下，构建cDN

7、A文库或基因组文库，然后用已知异显示技术)于苗期进行水分胁迫诱导检出l5个分子高保守序列制备同源探针，经标记后从相应的阳性克隆，l1个片段序列与已知序列有较高的同源文库中筛选阳性克隆，并经核酸序列分析鉴定所克性，4个片段同源性非常低，可能为新基因。田振东隆的基因。应用此方法，Tang等利用拟南芥同等用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个马铃源序列克隆到了DsFAD3，DsFAD7和DsFAD8的全薯富集晚疫病