刺槐无性系转化体系的建立及液泡型NaH逆向转运蛋白基因的克隆

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2、签名：导师签名：日期：2QQ6：巨：29山东农业大学硕士学位论文中文摘要刺槐∞D6加妇雄砌∞∞埘是一种多用途豆科固氮树种(观赏、木材、饲料、蜜源树种)，它生长快，材质好，因此已成为人工造林的首选树种。但其有限的耐盐能力却限制着其栽种范围，利用基因工程手段对其耐盐性进行改造是一条重盐碱地区发展刺槐林的重要途径。Na+在液泡内区隔化的关键因子液泡膜N谢逆向转运蛋白基因是植物耐盐基因工程的关键因子，本工作在建立刺槐优良无性系高效再生体系的基础上，利用天然的植物转基因系统一根癌农杆菌介导，在35S启动子驱动下，将来自于苜

3、蓿的抗盐基因肱订哂叼导入刺槐离体叶片。同时对刺槐液泡膜Na+／一逆向转运蛋白基因进行了克隆并对其功能进行了初步分析。试验选用的刺槐无性系为84053，利用其嫩茎、叶片和刺槐种子萌发后获得的子叶、下胚轴和幼胚作为外植体，分别研究愈伤组织形成与芽再生能力。嫩茎为外植体时，33．3％外植体产生了不定芽，每个外植体产生不定芽个数为2．3个；子叶培养中，40％的外植体形成愈伤组织，形成愈伤组织的速度慢，而且只有50％愈伤分化出1．2个芽；下胚轴培养中，7d就可以在下胚轴的两端产生大量愈伤并出现芽分化，平均1个外植体分化5个

4、芽，有的可达7．8个芽；叶片培养中采用两步法，平均每块分化愈伤块产生的有效嫩梢(大于1．Ocm)数量可达12个，该再生体系能够满足基因转化的需要，可以用于该刺槐无性系的遗传转化。试验对TDZ(砸di蛐0n1在刺槐离体叶片再生芽诱导中的作用进行了研究，结果表明在附加2ml；／uDz与0．1mg几NAA的培养基上芽再生效率最高，平均每块外植体产生15个不定芽，且TDz浓度越高，产生不定芽的数量越多。但是随着Ⅱ)z含量的增加，同时产生过多的愈伤组织，使再生芽不能正常伸长生长，试管苗玻璃化，并抑制芽的伸长生长。通过将再生

5、芽转移到含有少量Ⅱ)z0．05mg，L，同时添加BAO．5mg，L、MAAO．01mg几的培养基上进行继代培养，较好的解决了这一问题。根据分化根的数量和长度确定添加O．5mg／LmA的培养基可以最好地诱导剌槐试管苗根的分化。选用离体无菌叶片为外植体对苜蓿^说耵同源基因进行转化，获得了抗性芽。遗传转化过程如下：取新展开的试管苗幼嫩叶片接种于诱导培养基上预培养7d，用携带蓿抗盐基因ⅣH，的农杆菌菌株Gv310l浸染叶片刺槐无性系转化体系的建立及液泡型Na-／lr逆向转运蛋白基因的克隆8．12miⅡ，然后放置到诱导培养

6、基上共培养2-3d，除菌后，移入筛选培养基MSB5s+TDZ2mg，L+NAAo．1mg／L+头孢霉素(Cef)400mg／L+50mg几卡那霉素(1渤)预筛选30d，得到抗性愈伤。将抗性愈伤转到芽伸长附加BA0．5mg几，NAAO．Olm叽以及Ccf400m舡和25mg／LKan上的MSB5S培养基，最后得到3个抗性芽。但是，抗性芽转到含O．5m以mA的抗性生根培养基上，一直未能生根。以盐刺激后的植株幼根为材料，对刺槐液泡膜Na饥r逆向转运蛋白同源基因进行克隆。通过比较G曲BaIll【中己登录的多种植物液泡膜N

7、a+／矿逆向转运蛋白的氨基酸序列和核甘酸序列，根据保守序列设计一对简并引物，通过RT-PcR从刺槐中扩增出一315bpcDNA中间片段，根据此片段序列设计3’端特异引物，利用3tRACE得到576bp的3’端cDNA片段。根据3’端片段序列设计5’端特异引物，得到746bp的5’端cDNA片段。该基因命名为母删(RD6加缸芦P砌口∞c缸翮)，并在G皿Ba玎1【进行了登记，登记号为AY652727。用DNAM^N软件对获得的基因序列分析显示，砌脚编码的蛋白质含有491个氨基酸，与G∞Bank中的序列进行同源比较发现

8、，其氨基酸序列与多种植物的液泡型Na?，时逆向转运蛋白具有较高的同源性，其中与苜蓿的同源性最高，达87％，其次与毛白杨、棉花、拟南芥、滨黎的同源性均为76％，而与水稻0sNHA1、拟南芥AtsOSl和AlNHx8三个质膜型NaⅥ{+逆向转运蛋白的序列同源性非常低，分别约为24％，28％和25％。说明肋脚可能是液泡型N矿／矿逆向转运蛋白拟南芥^碱船的同源基因。关键词：刺槐；