嗜热毛壳菌热稳定纤维素酶（EGⅡ）的纯化及基因（cbh1、cbh2）的克隆和表达

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1、山东农业大学硕士学位论文嗜热毛壳菌热稳定纤维素酶（EGⅡ）的纯化及基因（cbh1、cbh2）的克隆和表达姓名：刘守安申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：李多川20060510关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位

2、论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：圭够铷签名妒口期：皇堑．∥知山东农业大学硕士学位论文嗜热毛壳菌cT2热稳定纤维素酶(EGII)的纯化及基因(c触J、曲^2)的克隆和表达摘要纤维素是地球上最丰富的碳水化合物质，可被纤维素酶转化成为葡萄糖。具有很大的开发前景。纤维素酶因其在整个领域潜在的应用价值而倍受关注，它，叮以用于纤维废物的生物转化，可以用于纺织、造纸、洗涤、饲料加工等工业领域，还可以用于酵母和丝状真菌的原生质体制备，进行菌株改良。传统上采用

3、化学方法控制纤维素降解难度大、成本高，对环境污染严重，而纤维素的生物降解有效克服了这些问题，不但提高了资源利用效率，而且增加了经济效益。嗜热真菌产生的纤维素酶在高温条件下具有高活力和稳定性，并且与中温真菌一样，嗜热真菌产生的各类纤维素酶普遍含有多种类型的组分。嗜热毛壳菌(国nefD州f“Ⅲ珐eM叩^f胁埘CT2)是一种广泛分布的，生长上限温度较高的一种嗜热真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，并且证明了其纤维素酶存在多个组分。本研究中e抽P瑚叩^池ⅢCT2在以乳糖为唯一碳源的合成培养基中诱导产生胞外纤维素酶，通过通过硫酸铵沉淀、Phenyl—sepharos

4、e疏水层析、DEAE．SepharoseFastFlow阴离子层析等步骤获得了凝胶电泳均一的内切伊葡聚糖酶。sDS—PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为30kDa。同时对该酶进行理化性质的研究。c抽eⅢ叩^““ⅢcT2内切伊葡聚糖酶的N．端I5个氨基酸序列为MNQLEvLSLOsMPAA，与其它已报道纤维素酶的N一端氨基酸序列同源性比较低，推测可能是一种新的内切纤维素酶组分。根据纤维二糖水解酶的氨基酸同源保守序列设计简并引物，克隆了C腑P，聊印^i乜ⅢCT2热稳定纤维二糖水解酶c6加基因，随后提取基因组DNA，克隆了其DNA序列，该序列长1950bp

5、，包含三个内含子区域。该基因在GenBank中注册号为D0020255。将c拍2基因与酵母表达载体口PIc9KEc础I和JⅣ讲I双酶切后体外连接构建了酵母分泌型表达载体pPIc9K／c6^?，转化巴斯德毕赤酵母获得了转酵母工程苗PGS—D，表达蛋嗜热毛壳菌CT2热稳定纤维素酶(EGn)的纯化及基因(拍^，、c6^2)的克隆和表达白达到1．5m∥mL，同时对重纤维二糖水解酶CBHII的性质进行了研究。同时根据真菌纤维二糖水解酶序列，分析比较筛选出一对引物，扩增纤维二糖水解酶(曲^』)基因，将该基因与酵母表达载体pPIc9K＆根I和^协I双酶切后体外连接构建

6、酵母分泌型表达载体pPIc9刚c砌』，重组质粒线性化后转化毕赤酵母GSll5感受态细胞，获得了转酵母工程菌PGS—H，经甲醇诱导获得了重组纤维二糖水解酶cBHI，表达量达1．42mg／mI，。关键词：嗜热毛壳菌，热稳定纤维素酶，纯化，cDNA克隆，表达山东农业大学硕士学位论文PurificatioⅡofThermostableCellulase(EGII)from劬仃踟．『，l觑腕砌Pr优叩^mf朋CT2andCloniⅡgaⅡdExpressionofGeⅡes(西^J、c6^2)AbstractCelluloselsbytarthemostabund

7、antcarbohydrateaVallableonearth，andcanbeconVertedintoglucosebycellulases．Cenulaseshavebeena亡tractedincreasingattentionduetotheir印plicationpotentialinthefieldsuchasbioconVersionsofcellulosewaste，text订eindust叫，p印erandpulpindus廿ies，deete曙enti11dustfyprotoplastsgeneration疗-0myeas￡a】1

8、d丘1砌etous血n百andsoon．HoweVer，merehaveseve