家蚕突变基因tub的SSR分子标记筛选与连锁定位分析

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1、中文摘要家蚕实验遗传图谱的研究历经近百年，已将300多个突变性状定位在230多个位点上。在酲南大学家蚕基因库中保存有600多种重要的突变体．许多与生产、遗传育种和重要的基因功能相关。一旦找到与之连锁的DNA分子标记，便可以将这些突变基因定位于染色体上并进一步克隆有关性状的基因，并有利于家蚕分子标记辅助育种的开展。家蚕遗传连锁图谱即是基础理论研究和实际应用的中间桥梁，又家蚕资源、育种及分子克隆等许多研究的理论依据和基础。迄今已经发表了包括经典连锁图谱和RFLP、RAPD、AFLP和SSR等分子遗传图谱，其中家蚕分子图谱和经典图谱的整合成为目前研究的热点和难点。本研究用家蚕的SSR引物对家蚕的近

2、等基因系材料进行遗传分析，筛选出与各连锁群标记基因连锁的SSR分子标记，进而用连锁的SSR分子标记进行标记基因的定位。期望能探索并建立一套基因的定位分析技术体系．为今后家蚕基因的克隆、亲缘分析、品种鉴定、遗传改良、资源保护、标记育种等相关研究奠定基础。主要结果如下：(1)SSR分子标记的筛选：本实验采用SSR．PCR技术，利用329个引物对家蚕6个连锁群的近等位基因系和回交亲本大造材料进行了SSR分析，初步筛选出分别在近等基因系闯揭示多态性的SSR分子标记27个，其中多态性标记较多的为第7连锁群的q基因的近等基因系和第16连锁群的cts基因的近等基因系，分别为to个和12个：第2连锁群的∥基

3、因，第4连锁群的L基因和第23连锁群的tub基因的近等基因系分别筛选到1个多态性标记。其中不同的碱基类型表现出不同的多态性。二碱基的SSR引物多态性水平较高。(2)SSR分子标记的连锁验证：将筛选得到的27个SSR引物分别用对应的近等基因系进行连锁验证．即先后进行亲本个体验证、系统验证、杂交验证及测序验证。首先将筛选获取的6个连锁群标记基因的SSR分子标记进行重复验证3次，均可得到稳定的结果。然后将筛选到的多态性SSR分子标记分别对各个亲本个体进行验证，结果发现除了第23连锁群的近等基因系亲本个体间无差异外，其它的连锁群均有一定程度的个体差异。这可能是因为所取近等基因系材料的遗传背景并不是完

4、全的相同，还是存在有个体差异所导致。将存在有个体差异的近等基因系亲本进行杂合度分析表明，各近等基因系内的平均杂合度在0．1600—0．3391之间。然后进一步用SSR标记PSSRF03进行系统验证，结果群体中表现为tub性状的个体扩增的带型与近等位基因系亲本带型一致。其次对SSR标记PSSRF03进行杂交验证。用家蚕23连锁群的近等位基因系与C108品种作为亲本，其F1代早与亲本回交产生BCI代验证群体。利用SSR标记PSSRF03对BCl代有tub性状个体和正常个体分别进行SSR分析，结果说明，SSR标记PSSRF03与第23连锁群tub基因紧密连锁。最后对第23连锁群tub基因的特异性片

5、断进行回收测序，序列表明此段特异性序列是包含一段AC重复的微卫星序列。(3)第23连锁群突变基因tub的连锁定位分析：用SSR标记PSSRF03对培育的第23连锁群的近等基因系与C108杂交的BCl定位群体(利用F1代6与亲本回交产生BCl代)进行SSR分析，在309个个体中，有149个表现tub表型的个体，其中有12个个体发生了单交换：另外162个正常个体中有11个发生了单交换，其后代的交换率为7．44％，即分子标记PSSRF03与tub西南大学硕士学位论文基因间的距离为7．44cM。(4)对突变基因tub的相关信息分析：本研究结合家蚕全基因组序列信息，将PSSRF03标记序列分剐在家蚕基

6、因组序列、家蚕EST序列和家蚕cds序列数据库及Gencbank数据库中进行同源检索，找到其对应的Scaffold4658：然后将Scaffold4658在softberry网站在线预测基因，同时检索到最新研究完成的家蚕SSR连锁图谱(PNAS,2005)中第23连锁群所包含的SSR标记分别对应的Scaffold，并分析了预测的基因，由此列出了家蚕第23连锁群上已知的所有Scaffold。与樽蚕(tub)相关的基因还在进一步的验证分析之中。关键词：家蚕近等基因系SSR分子标记tub基因连锁定位ABSTRACTTheresearchonsilkwormexperimentalgeneticma

7、phaslastfornearly100years，andmorethan300mutantcharactershavebeenlocatedin230lociincludingmanyimportantbiochemistrytraits．Therearemorethan600silkwormmutationsbreedsinthegenepoolbankoftheSouthweastUniversity,