河南番茄褪绿病毒的分子鉴定

《河南番茄褪绿病毒的分子鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、2015（12）：25-28中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文河南番茄褪绿病毒的分子鉴定胡京昂　万秀娟　李自娟　黄　文　李武高　应芳卿（郑州市蔬菜研究所，河南郑州450015）摘　要：2014年在河南省郑州、济源、新郑、中牟、扶沟等地发现大量保护地番茄植株的叶脉间出现褪绿症状，疑似由番茄褪绿病毒（Tomatochlorosisvirus，ToCV）侵染引起。以这5个地区的番茄病叶为样本提取总RNA，利用ToCVHSP70h（Heatshockprotein70homolog，热激蛋白70家族）基因的特异引物对样本进行RT-PCR检测，均扩增出约460bp大

2、小的目的条带。PCR产物测序和序列分析结果表明，该序列与国际上报道的ToCVHSP70h的序列相似性达到99%以上，表明ToCV是为害河南省番茄产区造成褪绿症状的主要病原之一。关键词：河南省；番茄褪绿病毒；RT-PCR；分子鉴定近几年来，由烟粉虱（Bemisiatabaci）传播间疑似感染ToCV的番茄叶片为样品，提取植物总的多种病毒病对国内番茄生产造成了巨大的损失，RNA，经RT-PCR、PCR检测和序列对比分析，以尤以番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurl期明确其病原，为进一步防治该病害奠定基础。virus，TYLCV）、番茄褪绿病毒（Tomatochloro

3、sis1　材料与方法virus，ToCV）和番茄侵染性褪绿病毒（Tomatoinfectiouschlorosisvirus，TICV）最为突出（张穗等，1.1　试验材料2006；胡京昂等，2010；胡京昂等，2013）。1.1.1　病毒样本　2014年8月在河南省郑州、1998年，美国佛罗里达州首次发现了番茄褪中牟、新郑、济源和扶沟等5个地区的番茄大棚绿病毒（Wisleretal．，1998），之后意大利、巴中，采集叶脉褪绿、黄化的番茄叶片，分别编号为西、以色列等国也相继进行了报道（Accottoetal．，T-ZZ、T-ZM、T-XZ、T-JY和T-FG，并同时采集

4、2001；Segevetal．，2004；Freitasetal．，2012）。该相应大棚中健康番茄叶片作为阴性对照。病毒属长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属1.1.2　生化试剂　TRIzol购自Invitrogen公司；-（Crinivirus），在自然条件下通过粉虱传播，可以RTaseM-MLV（RNaseH）、RNaseInhibitor购侵染茄科、番杏科、苋科、夹竹桃科、藜科、菊科自Promega公司；凝胶回收纯化试剂盒、Taq酶和蓝雪科等植物，不能通过摩擦接种传播（Winter-和DL2000Marker均购自杭州博日科技有限公mante

5、l&Wisler，2006）。司；dNTPs和T4DNALigase购自TaKaRa公司；TM我国最早于2013年发现番茄褪绿病毒，该病GeneFinder购自厦门百维信生物科技有限公司。毒会引起番茄叶片褪绿和黄化，尤以植株下部叶片1.1.3　菌株和载体　大肠杆菌（Escherichiacoli）叶脉浓绿，叶脉间褪绿、黄化最为明显，貌似缺素DH5α菌株由郑州市蔬菜生物技术重点实验室保症（Zhaoetal．，2013）。2014年8月，笔者在河南存。克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司。省郑州、济源、新郑、中牟、扶沟等地的番茄田间1.2　试验设计发现了大量疑似感染T

6、oCV的番茄植株。本文以田1.2.1　植物总RNA提取　采用TRIzol提取法，取番茄叶片样本约0.1g，在液氮中研磨后迅速转移胡京昂，男，博士，助理研究员，专业方向：植物病理学，E-mail：到1.5mLDEPC处理的离心管中，加入1mLTRIzolhujingang05@126.com-1试剂，振荡均匀放置室温5min后12000r·min收稿日期：2015-03-09；接受日期：2015-08-11基金项目：河南省现代农业产业技术体系建设专项（S2010-03-G02）离心5min，将上清液转移到新的DEPC处理的1.5—25—《中国蔬菜》学术论文下载

7、www.cnveg.org研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLESmL离心管中，加入0.2mL氯仿混匀，室温放置10HQ879846），日本分离物（登录号：AB513442），-1min后再次12000r·min离心15min，仍将上清韩国分离物（登录号：KP114528），中国山东分离液转移到DEPC处理的离心管中，加入0.5mL异丙物（登录号：KC709510）、南京分离物（登录号：-1醇混匀，-20℃静置30min后12000r·m