花生AhNCED1基因启动子的克隆与功能分析

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1、摘要花生彳办ⅣCED，基因启动子的克隆与功能分析专业：细胞生物学申请人：梁建华导师：李玲教授干旱是影响植物生长发育的主要逆境因子，能诱导许多参与逆境响应和耐受基因的表达。花生(ArachishypogaeaL．)是我国重要的油料和经济作物，降雨量少或季节性干旱仍是花生产量和品质的主要制约因素之一。因此，克隆干旱诱导基因的启动子对运用转基因技术提高花生的抗旱性非常重要。植物激素脱落酸(ABA)作为一种胁迫信号转导物质，在植物对水分胁迫的适应性反应中起着重要作用。在生物和非生物胁迫条件下，植物体内的ABA含量增加，这种效应主要是通过激活ABA合成及抑制其降解来实现，外施

2、ABA能显著提高作物的抗旱性。9一顺式环氧类胡萝b素双加氧酶(NCED)是调节ABA生物合成的关键限速酶，过量表达NCED基因能够提高转基因植物对胁迫条件的抗性。NCED基因的研究大多集中在拟南芥、豇豆、玉米等植物中。本实验室于2005年从耐旱品种粤油7号叶片中克隆出AhNCEDl基因。经实验证明，该基因受干旱诱导表达，是花生抗旱基因。而且，国内外对NCED基因启动子的研究也比较少。据报道，仅有拟南芥AtNCED基因家族启动子的时空表达模式被详细研究。但是，对作物NCED基因启动子的研究，国内外尚未见报道。本研究以花生耐旱品种粤油7号为材料，克隆了花生彳办ⅣCEDJ

3、基因的启动子片段，并在转基因拟南芥中研究其功能，主要获得了以下结果：1．利用基因组步行技术从花生基因组DNA中克隆了彳办ⅣCED，基因上游2446bp的启动子片段。Genbank登记号：EU497940。华南师范大学硕十学位论文2．生物信息学分析表明，AhNCEDl基因启动子片段含有9个重要的顺式作用元件，包括干旱和ABA响应元件(ABRE)、水杨酸响应元件(TCA．element)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA．motif)、伤害响应元件(WUN．motif)、防御与胁迫响应(TC．richrepeats)、胚特异表达元件(Skin．1motif)和3个光响应元

4、件。3．将AhNCEDI基因启动子片段与GUS报告基因组成融合基因，并通过根癌农杆菌转化拟南芥。通过GUS组织化学染色和GUS荧光定量检测，发现在转基因拟南芥的不同发育时期，AhNCEDI基因启动子在叶片中转录活性较强，而且具有响应300mmoI／L山梨醇和100mmoI／LNaCl胁迫的功能。外旌1009moI／LABA、2mmoI／LSA和509moI／LMeJA也能提高AhNCEDl基因启动子的转录活性。4．利用体外定点突变技术成功将预测的两个顺式作用元件ABREmotifA(．1380to．1375)和motifB(．1332to．1319)进行定点突变。将

5、经过定点突变的启动子与GUS报告基因组成融合基因，并通过根癌农杆菌转化拟南芥。通过GUS组织化学染色和GUS荧光定量检测，发现ABRE是响应干旱和ABA的关键区域。本研究分析了AhNCEDl基因启动子的功能，鉴定了两个响应干旱胁迫和ABA信号的顺式作用元件ABRE，为进一步研究AhNCEDl基因的表达调控机制及其响应水分胁迫的信号通路、分离ABA响应元件结合蛋白(AREB)和通过基因工程手段提高植物的抗旱能力奠定基础。关键词：花生AhNCEDl基因启动子ABA水分胁迫ABSTRACTCLONINGANDFUNCT10NANALYSIS0FTHEPROMOTEROFT

6、HE9一口／．弘EPOXYCAROTEN0IDIOXYGENASEGENElN月月纠C胃／SHYGoGAEA＼-．Major：CellBiologyName：JianhuaLiangSupervisor：LingLiDroughtisoneofthemajorabioticstressesthatlimitplantgrowthandproduction．Peanut(ArachishypogaeaL．)isanimportanteconomicagriculturalcrop，itsproductandqualityarebrieflyaffectedbydrou

7、ghtstress．Cloningofthepromoterofdehydration—induciblegeneofpeanutmaybeusefulforgeneticmodificationofdroughttoleranceincrops．Theplanthormoneabscisicacid(ABA)regulatestheplantadaptiveresponsetovariousenvironmentalstresses．TheendogenousABAlevelwillbeupregulatedbyactivitingbio．synthesisa