实验五土壤中细菌纯种分离和培养

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1、实验五土壤中细菌分离、纯化和培养一、目的要求1、初步掌握从土壤中分离和纯化细菌的基本方法。2、练习微生物接种和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多。用挑单孢法、稀释涂布平板法或平板划线法获得一种或一株微生物。三、仪器和材料样品：新鲜土壤培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基无菌水：带有玻璃珠装有90mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。其它：无菌培养皿(直径75毫米)、无菌玻璃移液管、酒精灯、培养箱等

2、。四、操作步骤细菌纯种分离的方法有两种：1、稀释平板法2、平板划线法（一）细菌纯种分离的操作方法（1）取样选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤，装入灭过菌的袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。1、稀释平板分离法（2）制备土壤稀释液◆将1瓶90mL和7管9mL的无菌水排列好，按10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。◆称取土样10g放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，用手摇10min，使土样均匀分散，制成（10-1）土壤悬液。◆在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管

3、吸取lmL10-1浓度的菌液于另一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。◆同样方法，依次稀释到10-6。注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管。①吸取菌液：用无菌移液管吸取菌液于无菌培养皿内。注意：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀。（3）平板的制作注意：在无菌培养皿底部注明稀释度。②倒平板：♫将融化并冷至约50℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入培养皿内。♫将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板（每组制培养皿3套）。③对照取“对照”的

4、无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖。（1）平板的制作将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。2、平板划线分离法（2）划线用接种环挑取一环土壤悬液，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（每组做三皿）。注意：切勿划破培养基划线的方式可取图中任何一种1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法（二）培养将前面制作的平板倒置于培养箱，30℃培养24～48h，然后观察结果。

5、（三）挑菌纯化在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，如果不纯，需进一步挑取此菌落采取稀释平板法或划线分离法分离，直至获得纯培养。分离平板制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀分散在稀释液中。注意无菌操作。平板划线要注意染菌，同时注意划线深度和密度。五、注意事项六、思考题1．分离土壤中的细菌时为什么要稀释？2．用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？3．如何检验平板上某个单菌落是不是纯培养？