实验蛋白质含量测定

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1、生物化学与分子生物学基础实验实验一几种蛋白质定量测定方法的比较生物化学与分子生物学基础实验1掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白质含量的原理和方法2掌握分光光度计的原理和使用方法实验目的生物化学与分子生物学基础实验①有多少样品可供分析;②蛋白质样品浓度大约是多少;③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质；④所选方法是否简单、可靠；⑤含量测定的专一性要求是否很高。选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑：生物化学与分子生物学基础实验常用的方法物理性质：紫外吸收法化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法（Bicin

2、choninicacid法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染法测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16％）。生物化学与分子生物学基础实验蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强烈吸收峰：280nm和190nm。280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子，苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸

3、收值差别很大(图1)。紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱图A是15μg/ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱，缓冲液为：0.01%Brij35,0.1MK2SO4,5mMKH2PO4,pH7。图B是10μg/mlRNA和DNA的吸收光谱。生物化学与分子生物学基础实验肽键在190nm有强吸收峰。一般分光光度计在190nm的光强较弱，且O2在此波长有吸收，因此通常使用205nm或210nm波长，Trp,Phe,Tyr,His,Cys,Met,andArg的侧链在此波长有吸收。优点：灵

4、敏，较稳定。缺点:干扰因素多。许多化学物质特别是含C＝C双键和C＝O双键的物质在此波长范围有吸收，所以必须严格控制反应条件。紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验优点：不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏；测量极其简单迅速；蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验缺点：干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收,所以一定要考虑样品中是否有核酸.要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件一致。敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。用标准曲线法测定蛋白

5、质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验管号01234567标准蛋白溶液（ml）01.01.52.02.53.04.00双蒸水（ml）4.03.02.52.01.51.000蛋白质含量(mg/ml)00.250.3750.50.6250.751.0未知蛋白溶液（ml）-------4.0A280操作步骤紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验考马斯亮蓝染色法（Bradford法）原理：该方法由Bradford于1976年建立。在酸性条件下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长由465nm（红色）转移为595nm（蓝色），

6、起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His,Lys,Tyr,Trp和Phe也有作用。2－5min呈最大光吸收，至少可稳定1小时生物化学与分子生物学基础实验简便,迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有干扰小于3000Da的多肽无法测定蛋白浓度高时非线性配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝G250考马斯亮蓝染色法（Bradford法）生物化学与分子生物学基础实验实验操作步骤室温放置5分钟后测595nm的光吸。考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇洗涤后，用双蒸水清洗。注意混匀，但不要剧烈震荡。考马斯亮蓝染色法（Bradford法）生物化学与分子

7、生物学基础实验原理：Folin-酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙组成。试剂甲中的Cu2+碱性条件下与肽键形成络合物并被还原成Cu+。Cu+以及蛋白质中的Tyr等的侧链基团与试剂乙反应，试剂乙中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的Tyr和Phe残基还原，产生蓝色化合物（钼兰和钨兰的混合物），显色反应在30分钟内接近极限。颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm下测光吸收。Folin-酚试剂法（Lowry法）生物化