波尔山羊精子体外获能及体外受精的研究

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1、四川农业大学硕士学位论文波尔山羊精子体外获能及体外受精的研究姓名：梁鑫申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：马恒东20040501摘要本试验就国内近些年来引进的波尔山羊进行了精子体外获能和体外受精的研究，利用去透明带仓鼠卵穿透试验和台盼蓝．姬姆萨双重顶体染色(TG)技术检测了精子的死活和获能效果，同时将获能的精子与体外培养成熟的屠宰山羊卵母细胞和超排山羊卵母细胞进行了体外受精试验。在获能液中孵育2—3h后，部分精子呈超激活运动方式，表现为激烈的穿梭运动和“鞭打样”运动。由此可以初步确认精子开始或已经获能。精子用离心法和上游法处理后的顶体反应率和活力表明

2、，上游法更有利于波尔山羊精子的处理。洗涤后的精子放入含有20p．g／ml肝素的T液(含6mg／mlBSA+10mmol／LHEPES)、B液(含2mg／mlBSA+5mmol／LHEPES)、D液(无BSA和HEPES)三种培养液中进行获能处理，结果表明T液处理波尔山羊精子的效果明显优于B液和D液，精子孵育4—6h的顶体反应率T组极显著高于D、B组(P0．

3、05)。无论是从顶体反应率还是从穿透率上看，肝素的添加剂量以209∥ml和50¨jml的效果较好，与20吲ml以下肝素组的效果相比差异极显著(P<0．01)，这两个水平之问效果差异不显著(P>0．05)。钙离子载体的添加剂量以O．31．tmol／L为宜，顶体反应率和去透明带仓鼠穿透率均高于其它剂量组。咖啡因与肝素、钙离子载体具有协同作用，尤其与钙离子载体的协同作用更加明显，去透明带仓鼠卵穿透率达到78．3％。无论是肝素还是钙离子载体，获能精子与去透明带仓鼠卵孵育4h和6h的穿透率均高于2h时的穿透率。经肝素诱导的获能精子与山羊成熟卵母细胞进行体外受精的适宜时间为17

4、h，时问短时精卵未完全结合，时间长则对受精卵的进一步发育不利。超排山羊卵母细胞的受精率略高于体外培养成熟的屠宰山羊卵母细胞。山羊的冻精比较脆弱，获能后活力急剧下降。从顶体反应率来看，鲜精的获能效果明显优于冻精，二者差异极显著(P<0．01)。关键词：波尔山羊精子顶体反应率穿透率体外受精20世纪50年代前，世界上只有少数科学家能成功地进行哺乳动物体外受精(Invitrofertilization，IVF)实验，且其结果不能重复，带有很大的偶然性，尚无体外受精的试管动物诞生。因此，人们～直对哺乳动物的体外受精持怀疑态度。直到1951年，美籍华人张明觉(ChangMc)㈣

5、和澳大利亚科学家Austint291几乎同时发现：哺乳动物精子必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程，才能获得受精能力。次年，Austin将这一现象称之为精子获能(capaeitation)。精子获能现象的发现被认为是体外受精史上的一个里程碑。自此，体外受精的研究蓬勃开展起来。1959年，张明觉利用获能处理的家兔精子进行体外受精实验，获得了世界上第～批体外受精的试管兔[35]。精子获能是一个多时期、多步骤的复杂变化过程。～般分为两个阶段：可逆性的生理上获能和不可逆性的结构上获能(即顶体反应，AcrosomeReaction，AR)。其实质是除去或改变质膜的稳定因子或保护

6、物质，使精子质膜对特殊的受精环境(尤其是对卵予)更敏感。起初的获能研究采取的都是体内获能，即先将精子放置于雌性生殖道几小时，然后收集并给另一个雌性动物授精，以受精率为指标来检测精子获能情况。这就需通过若干繁琐而经验化的步骤，而且也受到各种条件的限制。因此，体外获能的研究应运而生。1963年，Yanagimachi和Chang首次报道了成功进行金黄地鼠精子体外获能的实验，这一丌创性的工作大大加快了ⅣF的开展【841。早期研究精子体外获能通常使用各种动物的体液(如输卵管液、滤泡液和血清等)。但这些液体的成分相当复杂，很难确定是那种成分参与诱发或支持精子获能。自从Toyo

7、da等口列最先报道了采用一种特定的化学培养基取得体外受精成功以来，分析精子的体外获能也变得较为容易。体外获能技术可以较好地控制实验条件，并逐个分析获能因子及其相关因子。目前使用的体外受精和体外获能培养基是在台氏液和Krebs-Ringer。s溶液基础上添加适当的物质，如：葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、血清、白蛋白、肝素、钙离子载体以及一些生物活性物质(如咖啡因)改良而来。但不同种属的动物体外获能培养液的成分有所不同，这是因为不同动物精子功能的实现所需环境不尽相同。在体外获能机制的研究中发现精子获能是一个温度依赖性过程，同时需要一定的pH值和渗透压条件。获能时问的种问