生物样品前处理、制备、分离

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1、生物样品前处理、制备、分离及保存器材中国刑警学院法医系11.概述1.1生物样品处理制备的主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。⑵许多生物样品在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。⑶许多生物样品一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物样品提取制备最困难之处。⑷生物样品的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。21.2生物样品的处理制备通常可按以下步骤进行：①确定要制备的生物样品的

2、目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。②建立相应的可靠的分析测定方法，这是进行生物样品制备的关键。③通过文献调研和预备性实验，掌握生物样品及产物的物理化学性质。④生物材料的破碎和预处理。⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。⑥产物的浓缩，干燥和保存。32.生物大分子制备的前处理2.1生物材料的选择（1）制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。（2）选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。（3）动物组织要先除去结缔组织

3、、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。（4）植物要先去壳、除脂。（5）微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。（6）生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。42.2细胞的破碎不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。2.2.1细胞破碎方法(1)机械法1)研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量

4、石英砂研磨或匀浆。2)组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。5(2)物理法1)反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2)超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。多用于微生物材料，处理时间有数分钟到数十分钟不等，破碎细菌和酵母菌时，时间要长一些。

5、3)压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。4)冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。6(3)化学与生物化学方法1)自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2)溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的

6、稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。3)酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。4)有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。72.2.2细胞破碎相关的器械与器材1)电动组织捣碎机8电动组织捣碎机原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。市售仪器多数是可调速机型

7、，有不同口径、头端式样的转子供选择，平头转子适于制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制备组织和含纤维物质的匀浆。9电动组织捣碎机应用：一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械切力很大，制备较大分子样品很少使用。动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和细菌需加入石英砂加强效果。102）超声波细胞破碎机11超声波细胞破碎机原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器。由超声波发生器和超声换能器两部分构成。相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长

8、短、粗细，以满足0.1~250ml的容量需要。12超声波细胞破碎机应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡清洗及加速化学反应等。13超声波细胞破碎机使用注意事项：1.长时间运转将产生过热，注意降温，可采用间歇