整胚原位杂交

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1、组织学与病理学技术实验报告实验名称：使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚her4基因的表达使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚胎her4基因的表达一、实验目的：1）通过本实验掌握原位杂交的基本原理及方法。2）观察her4基因在斑马鱼胚胎的表达位置。二、实验原理：原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条

2、核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我

3、们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。三、实验试剂及仪器1、实验试剂：系统水、4%聚甲醛、PBS溶液、甲醇（70%、50％、30％）、蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1μl10mg

4、ml的蛋白酶K，终浓度10μg

5、ml）、H2O2（3%H2O2；0.5MNaOH）、PBST溶液、HYB溶液、RNA探针、50%甲酰胺、2×SSCT溶液、0.2×SSCT溶液、MABT、阻断溶液、羔羊清:MABT=1:9的溶液、AP底物染色缓冲液。所用试剂的配制：原位杂交中溶液的配制：保存溶

6、液配制1）10*PBS:每1L溶液：1.37M(mol/L的简写)NaCl80g27mMKCl2g43mMNa2HPO4·12HO(14.7g)或无水Na2HPO4（6.1g）14mMKH2PO41.9gDEPC水（购买）1LHCl调PH值至7.3灭菌2）PBST：PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。20*SSC:每1L溶液：0.3m柠檬酸钠88g3MNaCl175.3gDEPC水至1L灭菌3）SSCT：SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。4）HYB：每100ml溶液：50%甲酰胺5*SSC50μg/ml肝素0.5mg/

7、ml核糖体RNA加入Tween-20使其终浓度为0.1%-20℃保存5）MAB：1000ml100mM马来酸（顺丁烯二酸）11.69g150mMNaCl8.89g用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.54℃保存6）MABT：MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.7）10%阻断试剂阻断试剂粉末溶于MAB溶液中，质量体积比为1：10。高温高压灭菌，-20℃保存。8）热处理羔羊血清将羔羊血清56℃，30min热处理获得。分装，-20℃保存。现配溶液1）阻断溶液：2500ul热处理羔羊血清:10%BM阻断试剂:MABT=1:2:7。用后剩余溶液丢

8、弃，防止血清变质。2）检测缓冲液又称AP缓冲液每20ml溶液H2O16600μl100mMNaCl400μl50mMMgcl21000μl100mM三羟甲基氨基甲烷（Tris）─HCl2000μl10%Tween─20;200ul3）碱性磷酸酶底物染色缓冲液检测缓冲液1mlNBT/BCIP20μl2、实验器材及仪器：4℃冰箱、光学显微镜、正置相差荧光显微镜、恒温水浴锅、24孔板、EP管、移液枪四、实验步骤:本实验开始前已将胚胎固定好。固定方法如下：收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存

9、，二十四小时后用PBS溶液洗入水相，显微镜下剥去卵膜，然后换成甲醇，在-20C保存，待用。原位杂交第一天：1、重新水化和固定1）吸取固定好的胚胎，加入70%甲醇（MeOH）的PBST溶液，放置5分钟。2）置换成50％甲醇的PBST溶液，放置5分钟3）置换成30％甲醇的PBST溶液，放置5分钟4）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。5）用蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1μl10mg

10、ml的蛋白酶K，终浓度10μg

11、ml）在室温下处理胚胎，时间可参考下表：胚胎时期处理时间5S酌情处理6S30秒16S1分钟18S，24S2

12、分钟48h(H2O2脱色)4分钟3d(H2O2脱色)10分钟6）消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗。7）用PBST洗两