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1、如何选择理想的HPLC分析柱王峰Waters应用部©2009WatersCorporation
2、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation1色谱分析方法开发°方法开发：影响分离选择性主要因素——三角形关系溶剂类型pH乙腈or甲醇酸or碱等α选择性方法优化方法优化等度或梯度温度精细梯度调整流速色谱柱类型C18，C8，苯基等©2009WatersCorporation
3、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorpor
4、ation©2012WatersCorporation2严格的药物质量控制对色谱柱性能的要求和色谱柱选择方案°市场上有如此之多的C18柱（药典：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）°它们的性能都相似吗？°我如何选择？峰形不佳对积分准确度的影响拖尾因子=1.00拖尾因子=1.58积分后定量结果积分后定量结果99.9%97.8%99.8%95.3%99.6%99.6%92923%.3%©2009WatersCorporation
5、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012Wat
6、ersCorporation3选择性差异来源为什么这些硅胶反相C18填料如此不同？°色谱实验结果揭示：—疏水性不同—残留硅羟基活性不同—填料基质不同°为什么？—不同C18配体键合水平（状况）o配体覆盖率—不同硅胶颗粒基质o密度，表面积，孔径o纯度©2009WatersCorporation
7、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation4Waters色谱柱平台：设计优化于设计优化于pH稳定性选择性市场上MS兼容性最好的色谱柱多样性填料基质解
8、决不同的的分离问题1.7[UPLC],2.5,3.5,5and10µm1.7[UPLC],2.5,3.5and5µmCSH1.8[UPLC],2.5,3.5and5µmHSS©2009WatersCorporation
9、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation5高纯硅胶系列色谱柱常规应用©2009WatersCorporation
10、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012Waters
11、Corporation6高性能的保证：高纯硅胶填料传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响对羟基苯甲酸流动相pH7丁H3CH酯萘NCH3+二氢苊TfUSP=6.5阿米替林5152535Minutes45Minutes©2009WatersCorporation
12、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation7键合相硅胶基质填料PolyethoxysilaneTetraethoxysilane(PEOS)(TEOS)键合相(配体)：
13、C18端基封口基团合成步骤：残留硅羟基1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口硅胶基质©2009WatersCorporation
14、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation8碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理双重保留机理:与键合相的疏水性作用1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO-SiO-SiOHO-离子交换作用O-SiO-SiO-Si+O-SiOHHN(CH3)O-+2(CH)HNO
15、-SiO-Si32OHO-当流动相pH值小于O-SiO-Si当流动相为pH6-83时,硅醇基呈中性O-SiO-SiO-Si时,硅醇基带负电(未解离)O-SiOH性(大部解离)O-O-SiO--SiO-SiO-SiBase对碱性化合Base物的保留及严重拖尾©2009WatersCorporation
16、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation9碱性分析物在硅胶柱上的拖尾解决办法°提高Ｃ的键合密度—减少游离硅羟基—增加样品容量—增加保留—
17、提高分离度°良好的端基封尾—屏蔽游离硅羟基°改性填料和键合相°调整pH值°尝试离子交换和离子对色谱方法©2009WatersCorporation
18、COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation10WatersShield技术：内嵌极性配体的C18色谱
