Ni柱亲和层析

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1、镍琼脂糖凝胶FF一、简介金属螯合亲和色谱，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基2+2+2+2+3+酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子Cu，Zn，Ni，Co，Fe发生特殊的相互作用，利用这个原理可以把富含这类氨基酸的蛋白质吸附，从而达到分离的目的。由于这个原因，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。镍琼脂糖凝胶FF具有更高的载量，物理和化学稳定性好，批次重复性好，使用寿命长。已经螯合

2、好镍离子，使用更方便，由于颗粒粒度均匀，粒径小，所以分离效果更好，可完全代替进口产品。二、填料特征：特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便。基质6%的交联琼脂糖凝胶2+配基Ni配基密度50μmol/ml吸附载量≤45mg/ml填料的颗粒大小45-165μm最大流速300cm/hpH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11保存温度+4~8℃保存液体20%乙醇三、适用范围分离能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及带His标签的重组蛋白。四、应用实例实验名称：镍琼脂糖凝胶FF色谱分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20m

3、，柱床体积为10ml2、用缓冲液1平衡2-5个床体积，流速为2ml/min3、将20ml细胞破碎液(50mMPBS，pH7.4，0.5MNaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min4、用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2ml/min１北京卓冠科技有限公司北京市海淀区复兴路乙59号巨星大厦409室邮政编码：100036TEL：89631256FAX：681617815、用分别含10、20、50、100、200、300、400mMmM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度6、用纯

4、水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存7、色谱图见图1，SDS-PAGE结果见图2。缓冲液组成：缓冲液1：50mMpH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5MNaH2PO419ml，0.5MNa2HPO481ml，NaCl29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5MNaH2PO419ml，0.5MNa2HPO481ml，NaCl29.3g和咪唑34g,加适量水溶解后定容到1000ml。缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：

5、咪唑浓度缓冲液1量(ml)缓冲液2量(ml)10mM98220mM96450mM9010100mM8020200mM6040300mM4060400mM2080SDS-PAGE流程：1BCA法测量样品蛋白浓度2根据测定样品的蛋白浓度，算出5-10µg/孔所需的体积。3向1.5mlEP管中加入含5-10µg蛋白的样品溶液，若体积小于10µl，则加20mMPBSpH7.4补足10µl；若体积大于10µl，则要加入1ml无水乙醇，－20℃下浓缩1h。4取浓缩样品10000rpm离心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除残余的乙醇。5在样品加入20mMPBSpH7.4

6、和2×loadingbuffer各10µl，100℃下10min。取出后用冷却30s，4000rpm离心1s。6点样，电泳。实验结果：（一）使用镍螯合琼脂糖凝胶色谱分离His标签重组蛋白使用色谱填料为镍琼脂糖凝胶FF，His标签重组蛋白的上样量为20ml，用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液B进行洗脱，色谱结果见图3，色谱各组分的SDS-PAGE结果见图4。２北京卓冠科技有限公司北京市海淀区复兴路乙59号巨星大厦409室邮政编码：100036TEL：89631256FAX：68161781穿透洗脱10016550324A280(mA

7、u)00255075100125150175Vol(ml)图1.镍琼脂糖凝胶FF纯化带His标签重组蛋白123456789图2.SDS-PAGE图谱1：标准蛋白，2：上样液，3：穿透，4：20mM咪唑洗脱，5：50mM咪唑洗脱峰，6：100mM咪唑洗脱峰，7：200mM咪唑洗脱峰，8：300mM咪唑洗脱峰，9：400mM咪唑洗脱峰（二）镍螯合琼脂糖凝胶色谱分离His标签重组蛋白包涵体条件和前面的方法基本相同，只是缓冲液中加了8M的脲，溶液配方如下表，其纯化色谱图和电泳图见图3、4。要注意的是不同的包涵体溶解度不同，也可以用6M盐酸胍代替8M脲，因为盐