病毒诱导的基因沉默试验流程

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1、操作方法1：1.催芽，播种于含灭菌土的育苗盘中，待4-5叶期为合适苗龄。2.将含有pTV00（带目的基因）和pBINTR6的农杆菌从-70℃冰箱取出，在含有Kan50mg/L、Rif100mg/L和Tet5mg/L的LB/YEB固体培养基上划线培养，28℃，48h。挑取单一菌落在含有Kan50mg/L、Rif100mg/L和Tet5mg/L的LB/YEB液体培养基中转速250r/min，温度28℃，培养OD值约0.6-0.8。（大于24h？）3.取含有pTV00和pBINTR6的农杆菌GV31011：1混合，

2、6000r·min-1离心10min，弃去培养基，加入等体积MMA缓冲液，再将菌液室温下放置3h。4.拔出幼苗，剪去根尖，用菌液浸泡根5min。定植。用不带针头的注射器，将步骤3中准备好的混合菌液从嫩叶背面注射进叶片（约5ml/株）。剩余菌液灌根。将注射后的植株放置在温度16℃的培养箱内，黑暗培养，50%RH，24h。放置在温度低于24℃的培养箱内（20～22℃），光照16/8，50%RH。5.结果观察，14d后正对照（PDS基因沉默）植株新叶会出现光漂白现象，负对照无任何现象发生。1.14天后，接种南方根结

3、线虫200条/株。（30天）2.接种30天后，观察统计卵块根结数量。5月23日处理数：黄瓜、番茄各7个。5个带目的基因的pTV00载体菌株，1个正对照连接PDS基因的pTV00载体菌株，1个负对照空的pTV00载体菌株。苗数：280株。每个处理20株，每个处理共140株。处理液：每个处理500ml，其中浸根150ml/30株，注射5ml×30株，误差200ml。其中，目的基因菌液/MMA各250ml。则，含目的基因的农杆菌GV3101菌液量共250ml×7；含有pBINTR6的农杆菌GV3101菌液量1750

4、ml（250ml×7个处理）。培养基质：草炭过筛，与蛭石、珍珠岩1：1：1混和。MMA缓冲液（10mmol/LMgCl2；150μmol/L已酰丁香酮；1mmol/L2-N-吗啉基乙磺酸MES）储存液配制500mmol/LMgCl2·6H2O（50×）：10.1gMgCl2·6H2O固体溶于100mL蒸馏水中。100mmol/LMES（10×）：1.952gMES固体溶于100mL蒸馏水中。74mmol/L已酰丁香酮（AS）（500×）：145mg已酰丁香酮溶于10mL无水乙醇。工作液配制（100mL）500

5、mmol/LMgCl2·6H2O（50×）2mL100mmol/LMES（10×）10mL加入蒸馏水至100mL，过滤灭菌存于4℃冰箱，用之前加入74mmol/L已酰丁香酮（AS）（500×）0.2mL（或直接加AS29mg/L工作液）pTV00Keytosequenceannotation;www.ayeaye.tsl.ac.ukGreenplasmidbackbonesequenceBluesequenceinsertedtothepTV00orpGR107vectorsRedCaMV35Spromote

6、rsequenceUPPER-CASEtobraviruscDNAsequenceVioletNopalinesynthaseterminatorsequenceUPPER-CASEANDBOLDArabidopsisNIA1-intron3sequenceLower-caseandboldCaMV35SterminatorsequenceDarkgreenTobaccorattlevirusgenesforcoatprotein（CP）nptI1TTTTTATCCCCGGAAGCCTGTGGATAGAGGG

7、TAGTTATCCACGTGAAACCGCTAATGCCC61CGCAAAGCCTTGATTCACGGGGCTTTCCGGCCCGCTCCAAAAACTATCCACGTGAAATCG121CTAATCAGGGTACGTGAAATCGCTAATCGGAGTACGTGAAATCGCTAATAAGGTCACGTG181AAATCGCTAATCAAAAAGGCACGTGAGAACGCTAATAGCCCTTTCAGATCAACAGCTTGC241AAACACCCCTCGCTCCGGCAAGTAGTTACAGCAAGTA

8、GTATGTTCAATTAGCTTTTCAAT301TATGAATATATATATCAATTATTGGTCGCCCTTGGCTTGTGGACAATGCGCTACGCGCAC361CGGCTCCGCCCGTGGACAACCGCAAGCGGTTGCCCACCGTCGAGCGCCAGCGCCTTTGCC421CACAACCCGGCGGCCGGCCGCAACAGATCGTTTTATAAATTTTTTTTTT