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《大肠杆菌araC突变基因的分子克隆及DNA序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、一!∀#∃,%&,一,徽生物学报口点目口。翻讨。∋(+∗∋。通时砂)∗(大肠杆菌,(−突变基因的分子克隆及./0序列分析曾伟强1238+9+,北京3∗52,‘∗,627∋(!∗72,3∗(,4−):中国科学院遗传研究所、4∀(,二−;一1∃的<+,=大肠杆菌基因阿拉伯搪调节基因∀的一些突变体已克隆到质权<:。#−,。位点在转化(>基因缺失菌株‘?“后阿拉伯塘变构酶活力重新获得表达但突变#≅≅∃。通过./0对酶活力的影响呈三种类型!∀削弱∀无明显影响∀增强序列分,。析并与野生型进行比较已找到缺失突变或点突变的位置关+词阿拉伯糖调节基因≅突变体≅重组./0井序列分析一大肠杆菌对;阿拉
2、伯糖利用的酶是大肠杆菌Α+ΙΓϑΓ及噬菌体来自/(3汀·。2;ΕΕ。Α∋2!∗ϑ一‘?ΚΚ(,(−缺失由六个基因编码的(,Α基因编码渗透实验室系,,,(,(:菌株缺乏阿拉伯搪变构酶活性不能生长于阿拉酶(,Β基因编码外周蛋白(,基,。一,(伯塘培养基中因此选为受体菌久<(,(∋’系溶因编码;核酮糖激酶(,0基因编码变源性菌株,组成型,但有缺失或突变。,#;一一一Χ构酶(,.基因编码核酮糖磷酸二∀培并签人Δ一,(,(−(,(:0.变位酶是的调节基Λ0:=#ϑ#ΜΝ2+ΓΔΙΟ,培养基磷酸盐原液。#:人.。,(因(,的表达受∋基因编码ϑΜ,Ν2+ΚΙΟ,Μ#Ι=;Π2Θ!,硫酸盐原加至∀、一
3、#Ι≅,&Π2,+,的对该操纵子专一的调节蛋白的正与负液/Μ∀ΙΟΛ二?ΜΙΙΟ加‘,一,,。。,。Ε基因。,。:Φ3Μ#2=;Π2Θ!,Ι;一ΓΙΘ!,挤控制位于操至∀Ρ阿拉伯糖+#,>ΔΓ。((。ΓΡ维生素:呼Θ!ΓΙΡ水解酩蛋白氨基酸纵子的右端(,:0.和(,−的转,,2Θ!Μ2=;(,(:及(,(−之加至录起点都位于间的,!%。(三∀曲./0序列但两者方向相反(,−基,Σ+Ε(,Π23Ω,多核昔酸激酶是按1∗ΤΥ及Πς∗(因的表达则受(,−蛋白的自我负反馈调,。ΕΠ“方法稍加改进由/(3∋6;Ε实验室制备的。,(因此(,−+节基因编码蛋白具有正负调2,3。ΘΜ!Α∋:=
4、是%−(Ξ2实验室制备的加系,··节功能故该基因的突变可能改变其调节∋;ΠςΩ∗,ΕΠ,∗!Π23(3ΥΨ2Ω3&‘>!赠按Η法制,。性能>∗+,+Γ所以研究结构上的变化对研究备2Ν,>!、Μ‘口ΓΓΓ、Μ户口ΓΓ、Λ吞ΙΓΓ、Μ‘(!、Σ(叼=。,(−突变体的结构与功能的关系将大有Σ+/Ε9Α,&!(3Υ:=Ζ!(ΞΠ:ΕΧ及连接酶等从。(5Ε,!,,Λ0。,一,>Ν0ΣΝΛ(](Θ益处在此需要有野生型(,−基因及突购买的[∴是按变体基因的结构知识。1。。8+Η+等已克和8∗!ΞΕ,#‘,Γ改进的8!633和∋Τ(Ν沐ΓΓ‘,’交换(。,ΙΙΙ∃2ΙΙ∋∗「,Θ2!2隆了野生型,(−基因
5、并做了序列分析阁合成法制备的比活力一⊥本文报导(,(−突变体的分子克隆及其与四∀栽体·Ν:1∃./0被选为运载体,Α‘./人进。质粒从2=∗野生型行序列分析的比较结果勺材料和方法。本文于∴Ο_Κ年Γ月Ο日收到作老对(3‘6;,一∀菌株/Ε教授的指导和支持深表感谢曾##,./0伟强等大肠杆菌(−突变基因的分子克隆及序列分析获,‘’+,。(,(+1=中提取经抓化艳梯度离心纯化二∀−突变甚因的分子克隆化+五∀./0序列分析Γ<:1∃./0几<(,(+把及−./0(](Θ∗!ΞΕ,>‘+Γ。按Λ石化学法进行序列测定用<Π>Γ∃?℃消化Γ小时,然后Κ℃加,人。热ΓΙ分钟用乙醇沉淀./再把
6、./人结果,于ΣΔ溶于连接酶反应缓冲液中Γ℃用+。一∀几Ν(,(−./人连接酶连接过夜经聚丙烯酸胺凝胶电泳所有各株溶源菌冰冻千燥后室温贮检查连接前及连接后的反应情况图版一2。制./0,=Γ∀存备时首先接种千燥细胞于++,。Α‘#,ΠΘ!;:培养基中∃Ι℃摇床培养过夜翌2!△?ΚΚ培养过夜翌日接种3+!,∃Δ.‘ΙΙΘΚ日晨取此培养菌!Θ!同ΓΙΘ!Σ:培养基务量培养一小时至Ζ一Ι时,,,ΙΘΘ2!(−=,混合摇床培养Γ一ΓΚ小时后在一个体收集细胞用∃Ε处理后再用Ω5Ε,。积⎯;的ϑ!6瓶中加人ΟΙ2Θ!Σ:培连接好的重组./0转化受体细胞>∃∴处ΓΙΘ!新鲜培养菌,理后的细胞涂布于含
7、Γ产&⊥Θ!四环素及养基及置∃Ι℃通气培Ε,Γ一。养到ϑ!>比色计上Ζ.ΚΙ3ΘαΙ即把务;阿拉伯糖的Λ0:=选择性平皿上,,,ϑΤ∗65Ε瓶转到Δ℃水浴保温∃Ι分钟∃?℃培养二天后拣出平皿上的生长菌落∃,+并用含四环素及;一阿拉伯糖的0:=液再转到∃?℃培养小时可见到细菌裂Λ。。Χ解起泡沫培养液由乳白色混浊变为清体培养基培养扩增检测各转化体的;++·亮,表明噬菌体已完全从细胞内释放到培阿拉伯糖变构酶Α−
