细胞表面分子的检测与分析

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1、本次实验课流程课件讲述40min实验演示20min流式细胞仪硬件及软件介绍30min上机检测40min解惑答疑15min医学结构生物学研究中心柳卫凰细胞表面分子的检测与分析流式在细胞表面分子检测中的应用免疫细胞及其亚群的检测与功能分析例如：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等血液系统细胞表面标志的研究例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究、血小板分析辅助诊断相关疾病等细胞群体及细胞表面标志变化的监测例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化细胞表面标志构成性质的分析例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析标本来源外周血全

2、血溶血、PBMC骨髓穿刺液体液、灌洗液实体组织新鲜组织、石蜡包埋样本培养的细胞原代细胞细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞一、新鲜实体组织样本的制备酶消化法。常用的酶类试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等机械法。1、剪碎法2、网搓法3、研磨法化学处理法。常用试剂：0.2%EDTA0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化过程外，其余步骤最好在4度环境下操作，提高细胞活性。标本制备标本制备二、全血标本的制备“ABC”溶血（Beckman）取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次加入A液600ul，轻轻振荡15s；B液260ul,轻轻振荡15s

3、；C液100ul,振荡10s，免洗上机检测。“ACK”溶血（自配）以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反复2～3次，至红细胞完全溶解。细胞重悬后，再进行荧光标记。标本制备三、外周血单个核细胞的制备（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀；（2）沿试管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液Ficoll，勿用力过大；（3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层为分离液层，底层为红细胞层；（4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出，用生理盐水洗两遍，PBS

4、重悬；（5）荧光标记。四、贴壁细胞单细胞悬液的制备（1）将培养细胞用0.04％EDTA或0.25％胰酶消化3～7分钟，至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化液，加PBS；（2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中；（3）离心，1000r/min，5min；（4）加PBS洗两遍；（5）PBS重悬，将细胞吹打均匀；（6）荧光标记。标本制备标记方法直接免疫荧光法特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单。间接免疫荧光法特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非特异性染色，结果不易判断。（建议只用于单标检测）直接、间接混合染色法染色原则

5、：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直接标记。推荐！对照设置阴性对照调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值。常用的有：同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照阳性对照检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。空白对照确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。补偿对照多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节。同型对照（IsotypeControl）用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度⑤由未免疫动物血清纯化而来双色标记荧光补偿口

6、诀：横平竖直荧光补偿对照分析类型管功能加入的抗体单色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC双色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-

7、PC55Sample1,2……A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-ECDγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-ECDγ1-PC55Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDD-PC56Sample1,2……A-FITCB-PEC-ECDD-PC5注意事项样本的采集、储存样本的染色全血样本的溶血效果流式实验对照

8、的设置样本的采集手术切除的新鲜标本取材时，要避免出血