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1、ProteinExpressionProtocol:1.Transformcontrolconstructandtag-fusion-constructsintoE.coliBL21(DE3)competentcell,growovernight;2.Inoculatesinglecolonyto2~3mlLBmedium,andgrowat37degreefor7~10hoursorovernight;3.1:100inoculateto3mlLB,bacteriagrowfor2-3hoursat37degree,th
2、enfollow1:2000add1MIPTGtoinduceproteinexpressionovernightat22degree;4.Spindownbacteriaat12000rpmfor1min,washwith1mlddH2O,add100ul1xPBStoresuspendthedeposition,thensonicate3~5minonice;5.Spindownat12000rpmfor10min,separatethesupernatantsanddeposition;6.Boilingwithlo
3、adingbufferat100degreefor5min,Spindownat12000rpmfor5min,12%SDS-PAGE;7.Afterconfirmedproteinexpressedinsupernatants,increasethevolumeofbacteriamedium.1:100inoculateto100mlLB,growbacteriafor2-3hoursat37degree;thenfollow1:2000add1MIPTGtoinduceproteinexpressionovernig
4、htat22degree;8.Spindownbacteriaat8000rpm4degreefor5min,washwith10mlddH2O,add5ml1xPBStoresuspendthedeposition,thensonicate60minonice;9.Spindownat12000rpm4degreefor10min,separatethesupernatantsanddeposition;10.Preparethesupernatantsforpurification.蛋白表达注意事项：1.E.coliB
5、L21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化；2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。主要有以下方法可以减少包涵体的形成:a.降低IPTG的浓度。IPTG终浓度0.2～0.8μM都可以诱导细菌表达蛋白；b.加入IPTG后，把细菌生长温度降至16～30度。较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成；c.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖
6、可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl；d.供给丰富的培养基，优化培养条件，如供氧、pH等。3.超声后加入终浓度1%Tritonx-100处理30～60min，有利于去除膜碎片和膜蛋白；4.若需表达的蛋白含稀有密码子较多，尝试更换E.coli宿主菌株，如Rosseta。5.若表达毒性蛋白，造成细菌死亡或者生长缓慢，可以使用pLysS
7、菌株。GSTfusionproteinpurification（GlutathioneSepharose4B）Bufferpreparation：Waterandchemicalsusedforbufferpreparationshouldbeofhighpurity.Werecommendfilteringthebuffersbypassingthemthrougha0.45µmfilterbeforeuse.Bindingbuffer:PBS,pH7.3(140mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1
8、.8mMKH2PO4,pH7.3)Elutionbuffer:50mMTris-HCl,10mMreducedglutathione,pH8.0GST-xPurificationProtocol1.DeterminethevolumeofGlutathioneSepharose4Brequiredfor
