表达产物的分离纯化

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1、五、外源基因表达产物的分离纯化重组蛋白分离纯化方法选择的原则透析和超滤离子交换层析凝胶层析亲和层析原核生物表达的重组蛋白质量检测（一）重组蛋白分离纯化方法选择的原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化1、针对产物的表达形式采取不同的策略应先离心回收包涵体。样品体积大、浓度低，应在纯化前采用沉淀、超滤等方法浓缩处理。一般是胞内可溶性的，首选亲和层析纯化。包涵体型表达：分泌型表达：融合型表达：2、针对重组蛋白的性质选择不同的

2、层析类型1）离子交换层析：是等电点处于极端区域（pI≤5或pI≥8）重组蛋白的首选，易除去几乎所有的杂蛋白。前提是具备重组蛋白的特异性配体，如抗体、受体、底物等，且它们与目标蛋白间的解离常数Kd为10-8-10-4mol/L。2）亲和层析：3）疏水层析：根据蛋白质的疏水性差异分离。4）凝胶过滤层析：根据蛋白的分子量差异分离。3、多种分离纯化技术的联合运用重组蛋白纯化时，通常需综合使用多种技术。首先选择能除去含量最多杂质的方法；选择分离纯化方法时，应遵循下列原则：选择不同分离纯化机理的方法联合使用；尽量选择高效的分离方法；将最费

3、时、成本最高的分离纯化方法排在最后。4、合适分离纯化介质的选择常用的分离纯化介质：葡聚糖凝胶（Sephadex）琼脂糖凝胶（Sepherose）对目标蛋白有较高的分离效率；理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白不会造成变性；化学性能、机械性能稳定，重复性好；价格低廉。5、分离纯化过程的规模化蛋白质分离纯化的实验室方法，在产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上难以实现，如超声波破碎胞壁。实验室方法在规模化生产中成本过高，如超速离心。因此，实验室的技术路线=生产工艺。（二）透析和超滤透析：利用具有一定孔径大小、高分子溶质

4、不能透过的亲水膜，将含有高分子溶质和其它小分子溶质的溶液（左侧）与纯水或缓冲液（右侧）分隔，由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，左侧中的小分子溶质透向右侧，右侧中的水或缓冲液透向左侧。将蛋白质样品装入透析袋，置于盛有足量透析液的容器中透析，当袋内、外小分子趋于平衡时，更换透析液，产生新的浓度差，小分子继续向外扩散，如此多次重复，即可将大分子和小分子分离，分离取决于透析袋的截留分子量。脱盐；去除小分子杂质；置换缓冲液。透析的用途：实验室规模的蛋白质分离纯化。加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液超滤：具有一定孔径的半透膜

5、在一定压力下，膜内小分子能通过膜孔渗透到膜外，而大分子不能通过，使大小不同的分子达到分离的目的。实际上是一种高压渗透分离方法，通过在膜内施加正压、或在膜外施加负压，使小分子排出膜外。超滤的用途：脱盐；去除小分子杂质；浓缩；除菌。（三）离子交换层析离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本操作1、离子交换层析的基本原理以离子交换剂为固定相、以特定含离子溶液为流动相，利用离子交换剂与待分离的各种离子结合力的差异，将混合物中不同离子进行分离的层析技术。不结合的先被洗脱下来，结合力弱的其次

6、，结合力强的后被洗脱下来。阳离子交换层析2、离子交换剂的基本性质1）亦称离子交换介质，为不溶性高分子化合物，如树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。2）所含可解离基团在水溶液中能与其它阴、阳离子起交换作用。3）若有两种以上成分吸附在离子交换剂上，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的解离常数。4）通过改变pH，可使吸附在离子交换剂上的蛋白质失去电荷而解离下来。5）不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键的数目不同，即结合力大小不同，选择适当的洗脱条件（如改变离子强度），可将混合物中的成分逐个洗脱下来。离子交换剂的分类带正电荷，结合带负电荷

7、的蛋白质强碱型弱碱型阳离子交换剂：阴离子交换剂：选择阴离子还是阳离子交换剂，决定于被分离物质所带的电荷性质。带负电荷，结合带正电荷的蛋白质强酸型弱酸型强离子交换剂：弱离子交换剂：电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围窄。电离率基本不受pH影响，离子交换作用的pH范围宽。pH降低时，电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。弱阴离子交换剂：弱阳离子交换剂：pH升高时，电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。常用的离子交换剂1）离子交换树脂常见的是含酸性或碱性基团、人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物。优点：流速快，对小

8、分子物质的交换容量大，适于氨基酸、核苷酸等小分子物质的纯化。2）离子交换纤维素是携带功能基团的纤维素衍生物，有松散的亲水性网状结构和较大表面积，大分子可自由通过，对蛋白质等生物大分子的交换容量比离子交换树脂大。阳离子型：羟甲基纤维素(CM纤维素)；阴离子型：二乙基氨基乙基纤维