资源描述：
《海马细胞培养》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、细胞培养（普通混合培养）一、常规必备：1.溶液1)PDL:Sigma,Cat.No.:P-0899避光用超纯水配制好后过滤，200ul或400ul/tube分装,-20度储存。母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml(或PLL：Sigma,Cat.No.:P-9404)2)HBSS:1LNaCl8.4gKCl0.224gHEPES2.38g青霉素钠50万单位硫酸卡那霉素50万单位用1MNaOH将PH值调至7.1-7.2左右,再用超纯水将渗透压调至290±10，过滤，-4度储存。3）TrypsinSolution0.125%Trypsi
2、n(GibcoBRL(1:250),Cat.No.:27250-042)0.02%EDTA先用尽可能少量HBSS溶解EDTA（用1MNaOH调PH偏碱，EDTA溶解）。再加适量HBSS，用1MHCl还原PH，溶解Trypsin，最后定容。过滤，0.8ml/tube分装，-20度储存。4）DMEM（Dulbecco’sModifiedEagleMedium）GIBCOCat.No.:12100-046(Powder,10x1L)11952-092(Liquid,500ml)5）FBSGibco,Cat.No.:16000044,500ml分装：4m
3、l/tube,-20度储存6）F12(F-12NutrientMixture)GibcoCat.No.:21700-075(Powder,10x1L)11765-045(Liquid,500ml)7）NeurobasalMedia（withoutL-glutamine）Gibco,Cat.No.:21103-049,500ml8）B27Gibco,Cat.No.:17504-0449）GlutamateGibco,Cat.No.:25030-14910）CytosineArabinoside(阿糖胞甘)SIGMA,Cat.No.:C1768-10
4、0MG用DMEM溶液溶解，过滤，1ml/tube分装，-20度储存。（母液：500uM;工作液：5uM）2.器械解剖镜1台大剪刀1把短角形系结镊2把眼科剪2把止血钳3把二、准备工作（按时间顺序）1.培养前一天：高压灭菌玻片、25ml/100ml容量瓶、50ml离心管、15ml玻璃管、培养皿（直径大概70mm）、超纯水2.培养前：准备溶液含血清培养液：80%DMEM/10F12/10%FBS(使用前先在培养箱孵育2个小时左右)3.培养前：处理玻片用PDL工作液包被灭菌后的玻片，室温放置2个小时以上或-4度包被过夜。然后用灭菌好的超纯水洗三次，铺在3
5、5mm一次性培养皿内，晾干后用基配（DMEM）包被，培养箱孵育。待用。4．把解剖镜和解剖器械（眼科剪1把，止血钳1把和短角形系结镊2把）放到工作台内，UV照射20min左右三、种细胞1.取材1.动物房领鼠：SDratE17-182.工作台内准备：取冰袋、解剖液30ml和TrypsinSolution1管，用75%酒精消毒，放台内；35mm一次性培养皿3个放在冰袋上，盛上解剖液；把TrypsinSolution放进培养箱孵育；取出一个灭菌好的培养皿（直径大概70mm），用来装胚胎。3.取胚胎：先用75%酒精消毒器械（大剪刀1把，眼科剪1把，止血钳2
6、把）；用适量乙醚麻醉母鼠；“V”字形剪开腹部，取出胚胎，放在准备好的培养皿内；处死母鼠；清洗器械；收拾台面。4.工作台内取胎鼠海马：取下胎鼠脑袋（约6个），放进装有解剖液的一次性养皿内；左手用系结镊夹住两眼睛处固定脑袋；右手用系结镊划开脑颅、露出两大脑半球，镊子与脑干垂直、在嗅球前下压、往脑干处后拉、取出大脑，置于另一装有解剖液的培养皿；左手固定脑干，右手取出两大脑半球，置于另一装有解剖液的培养皿；去膜；解剖镜下取海马。2.消化1.取出孵育好的TrypsinSolution,把海马放进该消化液内；在培养箱内（37度）消化12-15min；收拾台面
7、；从培养箱取出处理好的玻片，将基配吸干。2.消化结束后，先用孵育好的含血清培养液终止酶反应，重复3-4次把酶溶液洗干净；将海马转移到灭菌好的15ml玻璃离心管内，加10ml左右培养液，用移液管或1ml移液枪轻轻吹打至悬液中无组织块；静置3-5min；去除部分上清液，将细胞悬液转移到原来装培养液的瓶子内稀释（注意：管底要剩余部分悬液，以防内含大块组织。）3.培养混匀最后稀释好的细胞悬液，种到吸干基配后的玻片上；标记好后尽快放进培养箱；24小时候换培养液。四、换液先提前把不含血清的培养液（1%Glutamate/2%B27/97%Neurobasal
8、Media）放进培养箱孵育;然后加血清（终浓度为10%），给昨天种好的细胞换液。
