资源描述：
《Transwell趋化实验》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、地区：上海简介：在A549细胞中过表达humanOct-4基因，通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定，研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。提供商：oobio服务名称：细胞侵袭侵袭小室实验摘要：在A549细胞中过表达humanOct-4基因，通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定，研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。实验结果显示Oct-4基因可以促进A549细胞的迁移能力。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。关键词：Oct-4，Transwell，A549，细胞迁移一、 实验原理Tran
2、swell小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。肿瘤侵袭实验：研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种
3、肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室，计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。二、 实验目的用质粒Oct-4-EGFP转染后的A549细胞与正常细胞组、阴性对照组进行比较分析，考察基因Oct-4对A549细胞的迁移能力产生的影响。三、 实验步骤实验共分以下4个主要步骤：1. 质粒转染细胞：准备A549细胞，转染前一天按照70-80%密度铺在6cm培养皿中。16h后，按照转染试剂说明书转染细胞（8μg质粒，20μllipofectamine2000转染试剂）。2. Transwell铺板；a) 转染12h后，胰酶消化，收集细胞：细胞计数
4、后，每个样品准备1×106cells/mL。b) 1,200rpm×5min离心后，重悬浮于1mL无血清培养基。c) 湿润小室：将300μL预热的无血清培养基加入到小室中，常温放置1~2h，将ECM膜湿润d) 将小室中的培养基去掉，24孔板中，没有小室的孔中加入500μL含10%血清的培养基e) 用镊子将小室轻轻放入预先加好培养基的孔中，尽量避免产生气泡f) 每个样品取300μL，加入到小室中，即3×105cells加入到小室中，37℃，5%CO2培养箱中培养 3. 细胞培养及染色；a) 培养箱中培养72h后，取出小室b) 用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉c) 24孔板中，没有小室的
5、孔中滴入15滴染色液（约500μL）d) 用镊子将小室轻轻放入预先加好染色液的孔中，尽量避免产生气泡e) 常温放置20min，进行染色f) 用去离子水洗3-5次，将背景洗掉g) 小室内边缘残留的细胞会影响实验结果，用棉棒擦干4. 统计分析。显微镜下拍照，使用Image-ProPlus软件进行细胞计数。四、 实验结果 图1.过表达Oct-4对A549细胞迁移能力的影响从左开始依次为A549空细胞组，NC对照组（过表达EGFP），实验组（过表达Oct-4-EGFP），每组实验均重复3次
6、 图2.过表达Oct-4对A549细胞迁移能力影响的统计分析**表示p<0.01结论：从实验结果以及进入小室的细胞的数量统计分析可以发现，A549细胞在过表达Oct-4-GFP72h以后，迁移能力均高于空细胞组以及对照组（p<0.01）。五、 参考文献1. KochKR,ZhangCO,KaczmarekP,BarchiJJr,GuoL,ShahjeeHM,KeayS.Theeffectofanovelfrizzled8-relatedantiproliferativ
7、efactoroninvitrocarcinomaandmelanomacellproliferationandinvasion.InvestNewDrugs.2012Oct;30(5):1849-64.、2. CarmonaFJ,VillanuevaA,VidalA,MuñozC,PuertasS,PeninRM,GomàM,LujambioA,PiulatsJM,MesíaR,Sánchez-CéspedesM,ManósM,CondomE,Eccle
