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1、广州师院学报(自然科学版)JOURNALOFGUANGZHOUNORMALUNWERSflY《NATUR红JSCIENCEEDFrION)第21卷一_第立塑No.3Vol.21高纯度线粒体DNA的快速提取’,2,2梅玉屏傅先元叶成仁..,,(1广东省中医院中心试验室广东广州510120;2广州师范学院生物系广东广州51叫。5),,摘要:报道了一种改进的线粒体DNA(而tochon曲alDNA皿DNA)提取方法该方法不仅,,,使提取mtDNA的周期缩短了而且操作简便提取的线粒体DNA结构完整并彻底避免了核、、、;DNA线杜体RNA蛋白质有机溶剂等的
2、污染该方法还可以根据不同的试脸要求而选取。,、、、相应的步骤与其他方法相比较该方法具有快速简便经济产品纯度高以及mtDNA结构完整等特点,mtl)。其得率和纯度均能满足NA的各种分析要求关键词:线拉体DNA;l;碱变性法DNase.中图分类号:Q343文献标识码:A文章编号:10[X)25%(2《X))仍硕洲刀压以,线粒体是真核细胞中普遍存在的一种重要而独特的细胞器对其遗传相对独立的。-自主性及生物发生的研究成为当前细胞生物学中非常活跃的领域川线粒体DNA(mtD、、、,NA)已被广泛应用于发病机理临床诊断遗传变异生物进化等多方面的研究并。,只。
3、取得了许多有价值的结果线粒体基因组结构简单有16肠左右[z]由于mtDNA的,,,。,-分子量小个体内有高度的均一性无组织特异性[s]所以便于取材分析同时mtD,NA又具有广泛的种内和种间多态性在亲缘关系相近的物种间其进化速度比核基因。开,快L4J展动物线粒体DNA结构与功能的研究对深人了解生物体发育过程中基因与、、调控的分子机理核质相互作用方式及分析生物种间种内的进化关系等都具有重要的”一7。,-意义〔〕赵兴波认为mtl〕NA在动物育种研究中有广泛的应用[s]张四明通过对mtD、,NA的研究探讨了方正银螂白卿和脚的遗传差异[9]曹莹利用mtDN
4、A对尼罗非卿和奥。。利亚非卿遗传差异进行了研究〔‘0]md)NA分析直接从宏观现象进人到微观分子水平。如何快速有效地提取mtl〕NA无疑成了进行这些方面研究的前提已有的mtDNA提取方法、、、概括起来可分为密度梯度离心法酶消化法柱层析法氯化艳超速离心法和碱变性。,,,法有的试剂昂贵;这些方法中如氯化艳有的试验条件要求十分严格如碱变性、,。,;有的操作繁杂法酶消化法如密度梯度离心法本文应用了其中的碱变性法对如。何快速高效地提取mtDNA进行了探讨:l8一一收稿日期男伪20:第3期梅玉屏等高纯度线粒体DNA的快速提取1材料和方法1.1材料、、本文以中
5、华鳖(2城,sis)红卿(‘d3ius)湘江野鲤(叹甲瓦哪~心二.、.、甲勿L爪厉匆讯ng乞砚nty)湘卿(Caius绷山’at出L四倍体鱼(儿加叩肠滋Ca~肠ng~二rit)、、.人)白卿(ca10aura。浏)湘云卿(命ioauL、约心几做几妙)等动户~如ha~~肠、、,物的肝脏性腺脾脏和肾脏组织为材料其中每种材料均采用了新鲜的活体解剖获得,;另有部分湘江野鲤和四倍体鱼采用了经过20℃冰冻的组织来进行试验组织部分湘。卿和四倍体鱼采用冰壶(4℃)经短途运至实验室的方式来取材试验材料均取自湖南湘阴。,、。东湖渔场除湘云卿外每种动物均选用了雌雄两种
6、个体1.2溶液.,一,.:刃FLs,1SE缓冲夜025二l/L蔗糖3otn、HCI10minOFLN处EDTA25In犯l/LCaC犯,州7.5。.,一,.,.nSTM溶液:025nloUL蔗糖ro皿朋l/LsHCI05FLMgC贬pHSocTri..r:110,s一,1~,p1SrE溶液0251/L蔗糖roFLTriHCI1~l/LE以rAHSo.,.。nUoW05以通/LEDTApHS0一,·V:rol/LsI,10FLE0.巧LI,80o溶液TriHCNazNaC叫TEN.~~DTAha,。Vll%SDS含021加1/LNH(临用前用ro%
7、S和1伽FLNa0H新配制)aoDSc:叮的十,c一。珊KA溶液其中含3FLK5,FLA。e珊DNasl溶液。仄DNase毛℃e的RNaseA溶液,.一,.X酚:05FL的sHcl>780取重蒸酚用InoTri饱和使其PH1.3操作程序,,,一(l)取289动物组织于少量SE溶液中漂洗剪碎加约30而的SE溶液匀浆,,。以2以刃离心ro而n;取上清液以150rpm离心巧而n沉淀物为线粒体用sIMrpm。溶液洗一遍.,:e(2)以溶液体积与组织重量之比为02而19的,rM溶液悬浮线粒体加D刊公l溶,,」,液(终浓度达10拌g/耐)30℃温浴30而n;
8、加EDTA溶液(终浓度为20ol/I)n,.,,:In混匀加溶液体积与组织重量之比为16而19的STE溶液摇匀以2。以〕印离心10。,,
