稳定细胞系建立学习

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（５）：１７～２２ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１稳定细胞系的建立及特性研究张巨程杰陈静易娟孙静魏虎来（兰州大学基础医学院医学实验中心兰州７３００００）摘要将已构建好的含有人多药耐药（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＭＤＲ）全长基因的真核表达质粒ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１，应用脂质体导入人肝癌ＨｅｐＧ２细胞，应用Ｇ４１８筛选出人肝癌多药耐药细胞株ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１。通过对ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞形态学的观察和生物学特性的研究，成功地建立了高效、稳定的ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞系；为深入研究肝癌的ＭＤＲ

2、及其逆转提供了理想的细胞模型，并为探索建立肝癌ＭＤＲ细胞株提供新的方法和思路，同时为研究肝癌细胞胰岛素抵抗与ＭＤＲ的关系提供了模型细胞。关键词多药耐药人肝癌ＨｅｐＧ２细胞转染ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１重组质粒中图分类号Ｑ８１３肝癌的综合治疗中化疗是目前最重要的方法之ＡＤＭ）为浙江海正药业股份有限公司产品；Ｔｒｉｚｏｌ为［１．２］一，但多药耐药现象的产生是影响其疗效的瓶颈。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；ＡＭＶ、ＰＣＲ试剂盒、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ研究表明，在肿瘤细胞多药耐药的机理中，ｍｄｒ１基因及两步法ＲＴ?ＰＣＲ实时荧光定量试剂盒和ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ其产物Ｐ?糖

3、蛋白（Ｐ?ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐ?ｇｐ）过度表达是最主购自ＴａＫａＲａ公司；ｍｄｒ１、β?ａｃｔｉｎ引物由ＴａＫａＲａ公司合要的因素之一。研究表明，抑制ｍｄｒ１基因的表达可提成。其余试剂均为进口或国产分析纯。［３］高耐药细胞对化疗药物的敏感性，同时，首次发现胰１．２方法［４］岛素抵抗的肝癌细胞ｍｄｒ１／Ｐ?ｇｐ表达增高。藉此，本１．２．１ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１重组质粒的提取与纯化用携带研究将携带人类全长ｍｄｒ１ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＣＩ?有人类全长ｍｄｒ１ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１转ｎｅｏ?ｍｄｒ１转入人肝癌ＨｅｐＧ２细胞，成功地筛选出高

4、效、化感受态细胞ＪＭ１０９后，涂布在含有氨苄青霉素的ＬＢ稳定且耐药机理明确的多药耐药细胞株ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１，平板上，挑取单个的阳性菌落接种于含有氨苄青霉素并测定了其生长曲线、ｍｄｒ１ｍＲＮＡ和Ｐ?ｇｐ的表达及Ｐ?的ＬＢ中，震荡培养过夜。提取、纯化质粒，经ＰＣＲ鉴定ｇｐ的功能等生物学特性，为进一步研究肝癌细胞耐药为阳性，并测定其浓度的质粒溶液置于－２０℃备用。机制及其逆转，以及肝癌细胞胰岛素抵抗与Ｐ?ｇｐ的关１．２．２ＨｅｐＧ２细胞的培养及ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１的转染复苏系提供理想的细胞模型。后的ＨｅｐＧ２细胞转于含１０％新生牛血清的低糖ＤＭＥＭ完１材料与方法

5、全培养基中，在３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度条件下培养，每周传代２～３次，取对数生长期的细胞用于试验。１．１材料转染前１ｄ，取生长状态良好的ＨｅｐＧ２细胞，常规１．１．１重组质粒与细胞人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２细胞消化后，用无抗生素的完全培养基稀释至浓度为１×由兰州大学医学实验中心保存，携带有人类全长ｍｄｒ１６１０单细胞悬液，在６孔板中每孔加入２ｍｌ细胞悬液，ｃＤＮＡ的重组质粒ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１由四川大学医学中心置于３７℃、５％ＣＯ的孵箱中培养过夜，当孔内贴壁细构建和惠赠。２１．１．２试剂ＬｉｐｏｆｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ、质粒提取胞达到９０％

6、～９５％时进行转染。在加入脂质体包被的试剂盒购自北京天根公司；罗丹明１２３（Ｒｈ１２３）、低糖ＤＮＡ前２ｈ，６孔板中细胞培养液换为无血清培养基继ＤＭＥＭ培养基购自Ｓｉｇｍａ公司；阿霉素（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，续培养。在待转染的ＨｅｐＧ２细胞孵育期间，用ｐＨ７．２的ＤＭＥＭ分别将４μｇ的ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１和１０μｌ的脂质收稿日期：２００８１１１３修回日期：２００８１２１１通讯作者，电子信箱：ｗｅｉｈｕｌａｉ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ体（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）各稀释至２５０μｌ，轻柔混合后，室温下１８中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ

7、ｙＶｏｌ．２９Ｎｏ．５２００９静置２０ｍｉｎ，形成脂质体／ＤＮＡ混合物后。按比例依次ｍｄｒ１ｍＲＮＡ的表达变化分别收集对数生长期的第加入６孔板的相应孔内，轻轻摇晃混匀后。于３７℃孵２０代ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１及对照ＨｅｐＧ２细胞，Ｔｒｉｚｏｌ提取总育２４ｈ后，消化传代。ＲＮＡ。以β?ａｃｔｉｎ为内参、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ为指示剂，利用１．２．３ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞的筛选与传代将上述转染所设计的引物（ｍｄｒｌ引物的上、下游序列分别为：５′?后的细胞消化传代于含１５％血清的完全培养基中培养ＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧ?３′和５′?ＧＴＴＣＡＡ２４ｈ后，即

8、转染后的第