胚胎植入前遗传学诊断的失误及改进

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1、胚胎植入前遗传学诊断的失误及改进 朱前勇　综述　颜建华　审校 　　20世纪90年代初以来，随着分子生物学技术的日益完善，胚胎植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis，PGD)的发展十分迅速，临床上可以鉴定性别，诊断多种单基因病及染色体病，全世界已有近百例婴儿经PGD后诞生。但临床上PGD仍存在20%左右的误诊率［1］，主要在于微活检技术的有效性不足和PGD常用的两种分析方法，即聚合酶链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH)在利用单细胞做底物时存在着缺陷。许多学者针对这些原因开展了一些新的方法，本文就PGD的误

2、诊原因及改进作一综述。 1　显微活检技术的有效性 　　PGD无论从卵细胞的极体还是从卵裂球中取材，都需要运用微活检技术，这是PGD技术的一个难点。Reubinoff［2］报道：28%的卵细胞由于活检操作失误而不能用于PGD，原因在于分离紧密连接的卵裂球能损伤细胞膜。Shee［3］把常规活检时分别用来固定囊胚、酸溶透明带、抽吸卵裂球的3个吸管，减少为用2个，1个仍固定囊胚，另1个先用酸溶蚀透明带，然后把酸吸回再抽出卵裂球。这大大缩短了活检时间，且在透明带上溶开的孔径与吸管直径相同但略小于卵裂球的直径，从而避免活检后细胞质流出和细胞膜破裂。该法使活检的有

3、效性提高了10%［3］。另外，Cieslak报道新开展的三维透明带部分切开术用于卵裂球活检，是在透明带上做一个V形切开(交叉裂口)，造成一个三角边口，足够微吸管进入胚胎取出裂殖细胞。行胚胎活检时，转动胚胎直至V形切口置于3点处，固定胚胎，微管进入焦距，施少许压力向上压开三角形叶片即插入胚胎，能在不扭曲胚胎卵裂球外形下吸出裂殖细胞，三角叶片在微管离去后复位，在移植过程中可保护胚胎。该术不同于用微针在透明带上造一裂口的传统方法，是一种安全、简单、有效的机械性透明带部分切开造口术。Markus用激光在透明带上打孔但尚未用于人胚检查。总之，如何提高显微活检技

4、术的准确性及有效性还需进一步研究。 2　如何避免PCR中等位基因的缺失及提高PCR的效率 　　1985年PCR技术建立后，Handyside于1990年首先应用于临床PGD，1994年Ray利用单细胞底物以PCR诊断囊性纤维病(CF)时，发现了等位基因的缺失现象(alleledrop-out，ADO)，即：以单细胞底物诊断单基因缺陷病时，如在杂合子的单细胞中，两个等位基因之一未被扩增。这是导致PGD误诊的主要原因。ADO在理论上由Navidi和Arnheim在1991年提出，1994年才在临床上引起足够重视。Grifo在1994年、Verlinsky

5、在1996年相继报道过ADO导致误诊的病例。Ray在诊断CF△F508基因突变时，出现了25%的ADO率［4］。Levinson在1992年利用多重PCR鉴定胎儿性别的研究中其ADO率是21%。最低的ADO率是Storm在168个杂合子细胞的扩增中仅一个表现为ADO(0.6%)［1］。在原位PCR中，ADO的发生率也有12%［5］。 　　ADO发生的原因主要为：①染色体嵌合体，尤其是除了具有二倍体细胞外，有些细胞是单倍体时，易致误诊，减少这类误诊的唯一办法是从1个囊胚中取2个细胞来分析。②在操作前溶细胞的方法对ADO率的影响较大，用强碱溶解，ADO率

6、较低，Gitlin、Wu等用强碱和DTT及蛋白酶K两种方法溶细胞，然后用PCR诊断CF△F508时，ADO率分别为10%和19%。③PCR开始时的变性温度也非常关键，变性温度分别为90℃、93℃、96℃时，用PCR诊断CF△F508基因突变时，ADO率依次为21%、13%、5%［6］。 　　此外，为了降低ADO率，除了上述严格的溶细胞条件、变性温度外，许多学者建立了一些新方法。Findlay提出荧光PCR，即PCR产物通过荧光标记的引物被标记上了荧光，较容易检测，此项技术较常规PCR灵敏［7，8］。Sermon利用荧光PCR诊断CF△F508突变，A

7、DO率仅5%，用常规PCR对比则为21%［1］。Kuliev［9］利用细胞的第一、二极体诊断Β-地中海贫血时，从一个杂合子细胞中同时扩增二个突变基因，如扩增结果表现为纯合子，则表明出现了ADO。Sermon又介绍了多态PCR：扩增CF△F508突变和其附近的具有多态性的第六内含子。根据两个位点的一致性结果来做出诊断是否出现了ADO，从而避免误诊［1］。 3　FISH和原位PCR 　　FISH运用于PGD，首先是鉴别胎儿性别以避免性连锁遗传病的发生，因可同时检测X、Y染色体，准确性较PCR高；其次可用来诊断染色体非整倍体。重要的是FISH可以诊断复杂的

8、染色体易位、转位等畸变，但目前关于这方面的进展不大，主要是卵裂球中期核染色体不易获得；且每例病人都要用一种特