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《分光光度法快速测定乳链菌肽效价_吴兆亮》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第34卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报特刊2006年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistryS227~S230分光光度法快速测定乳链菌肽效价*1112吴兆亮贾永生谭相伟于广和12(河北工业大学生物工程系,天津300130)(天津康益生物有限公司,天津300130)摘要为了解决琼脂扩散法测定乳链菌肽效价时间长的问题,引进了分光光度测定法。确定的测定工艺为:藤黄微球菌接种接种龄为指数期的中后期、接种量为10%的,加入待检样品在温度33e、转速150r/min的摇床培养5h,600nm波长下
2、测定吸光度值,通过乳酸菌肽浓度与检测菌吸光度之间的函数关系准确测量乳酸菌肽的效价。重复测定的最大相对误差在?5%以内。关键词乳链菌肽,效价,快速测定,分光光度法1引言乳酸链球菌素(nisin),又称乳链菌肽,是由乳品发酵微生物Lactococcuslactisssplactis产生的一个多+[1,2]肽抗菌物质,能有效抑制引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌(G)及病原菌的繁殖,是一种纯天然食品防腐剂。目前,我国已批准乳链菌肽可以作为一种纯天然食品防腐剂使用,广泛用于乳制品、发酵[3]饮品、罐藏食品,肉类及肉制品的防腐保鲜等。乳酸链球菌
3、素的生产方法为微生物发酵法。目前,用于检测乳酸链球菌素生物活性的最常用方法[4]是琼脂扩散法,其原理是在琼脂表面利用检测菌的生长显示出抑菌效果。为了提高测定的准确性,[5]++辛宇等研究了二剂量法影响因素,确定了效价计算的C运算程序。但运用该法检测所需时间超过20h的培养才能观察到清晰的抑菌圈从而得到准确的结果,不能满足工业生产中快速反馈各生产环节[6]产品生物活性的要求。在乳酸链球菌素的发酵生产过程中,必须随时掌握发酵以及分离过程中乳酸链球菌素的变化情况,以便及时改变生产工艺条件,特别是只有确定分离后的乳酸链球菌素的效价,才能进
4、行喷雾干燥操作。然而目前工业生产过程中主要根据经验进行操作,因此很有必要开发一种快速[7][8]准确的效价检测方法。Flores等利用试管培养法定量测定Nisin生物活性。Turcotte等以厌氧菌片球菌为指示菌,运用96孔聚乙烯板法,并利用自制的微盘分光光度计对比浊度法测定了Nisin生物活性。本研究利用的指示剂为普遍应用于抗生素效价测定的藤黄微球菌,采用有氧摇床培养的方法,深入地研究了乳酸链球菌素活性的影响因素,建立了分光光度法快速测定乳酸链球菌素生物活性的方法。2实验部分2.1仪器及试剂752型可见分光光度计(上海精密科学仪
5、器有限公司);检测指示菌藤黄微球菌的培养用摇床;200LL及1000LL微量加样器(SOCOREX.Swiss公司);5mL加样器及50mL分装瓶(BRAND.Germany公司)。Nisin标准品(Sigma公司),藤黄微球菌Micrococcusluteus(天津康益生物工程有限公司)。其它药品均为国产分析纯试剂。2.2实验方法62.2.1Nisin标准液的配制准确称取10mgNisin标准品(10IU/mL),溶于10mL0102mol/LHCl3中,配制成10IU/mLNisin标准液备用,需要时用0102mol/LHCl
6、稀释成1125、215、5、10、20和40IU/mL6种效价的标准溶液。2.2.2检测菌菌悬液的制备将检测菌接至斜面37e培养箱中培养48h,置于冰箱备用,贮存期不超过14d。自斜面取检测菌接入100mL三角瓶中置于摇床培养若干小时后置于冰箱备用,作为检测时的种子液。2005-10-21收稿;2006-01-17接受228分析化学第34卷[9]2.2.3CM检测培养基的制备Tween20与水(1+1)混和物012%,胰蛋白胨018%,葡萄糖015%,HCl015%,酵母抽提物015%,Na2HPO4012%,pH618。115e
7、灭菌20min。具体方法是将检测菌接种到液体培养基中,同时向其中加入一定浓度的Nisin溶液,然后将已接种的培养基放入摇床中在一定条件下进行培养。在此过程中,Nisin对检测菌的生长形成抑制作用,这种抑制作用的大小取决于加入的Nisin溶液浓度以及接入的检测菌浓度和生长活性。因此,如能将接入的检测菌标准化,那么在相同的条件下检测菌的生长与加入的Nisin生物活性呈一定函数关系,这种关系就可通过Nisin效价与检测菌吸光度的关系而得到反映。3结果与讨论3.1藤黄微球菌生长曲线的确定分光光度法快速检测样品中乳链菌肽生物活性是利用检测指
8、示菌藤黄微球菌培养物对光选择性吸[8]收的分析方法,通过Nisin效价与检测菌吸光度的函数关系进行定量检测。以10%的接种量,通过在37e,摇床转速120r/min条件下培养藤黄微球菌,600nm处每小时检测一次培养物的吸光度,结果如图1所示。藤黄
