发展中的DNA测序技术

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1、《生物工程进展》1997,Vol.17,No.4发展中的DNA测序技术*赵晓娟刘金毅综述蔡有余琦祖和审校(中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所北京)DNA序列分析是基因工程和分子生物学合酶合成出一系列以ddNTP为3′末端的不同领域最重要的技术之一,是了解基因结构和功长度的新链,电泳和放射自显影后,能迅速地读能的基础。“人类基因组计划”(humangenome出DNA序列。双脱氧法不仅具有化学法的优project)的实施,有力地推动了高速DNA测序点,而且极适于大规模测序。不久,Messing等技术的发展。除经典的测序方法在

2、技术环节上引入噬菌体M13DNA为克隆载体,使单链[1]的不断改进外,近年来发展了一些全新的DNADNA制备的困难迎刃而解。至此,双脱氧法测序方法,如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝结合M13克隆成为获取DNA序列信息的一胶电泳法、超薄层凝胶板电泳法以及不用电泳种最经典方法。之后,人们在DNA序列分析的分离的直接测序技术,如杂交法、质谱法、原子基本策略、提高测序的精度及效果等方面进行探针法、流动式单分子荧光检测法等。了不懈的努力。例如,1982年,洪国藩建立了经典的DNA测序就其原理来说主要分为“非随机”DNA序列测定法,使测序速度明

3、显提[2]化学测序法和双脱氧链终止法。1977年,Max-高;由于双链DNA测序省去了M13测序亚[3]am和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA克隆的构建这一步骤,近些年来倍受欢迎;使序列的方法。这一方法是将模板DNA的一端用碱基类似物dITP或7-deaza-dGTP取代标记之后,在四组或五组互为独立的化学反应dGTP,减少了凝胶电泳后压缩效应给阅读带中分别得到部分降解,其中每一组反应特异地来的麻烦;各种DNA聚合酶的改进,如人工修针对某一种或某一类碱基。在这几组反应中,通饰的T7DNA聚合酶(也称测序酶Sequenase

4、);过化学裂解形成具有共同起点而终点不同的放使用S-dATP标记和缓冲液梯度胶分离,改善射性标记的分子。经过电泳及放射后自显影可了电泳图谱的可读性,增加DNA顺序的可读以读出距离标记位点250个核苷酸以内的长度等等。DNA序列,不仅适于单链,也可用于双链测序。以下主要就近年来DNA测序中的重大改到目前为止,这一技术在模板DNA标记和特进作一概述。异性化学反应方面都进行了改进,DNA序列的一、非放射性物质的使用可读性也随之提高,成为DNA序列分析的基本方法之一。同年,Sanger推出了双脱氧链终随着人们对放射性同位素对人体危害的进止法

5、。用链终止剂2′,3′-双脱氧核苷三磷酸一步认识,在许多实验室已经使用非放射性物(ddNTP)取代一种脱氧核苷三磷酸(dNTP),质取代放射性同位素。利用地高辛和生物素测其中dATP可用放射性同位素标记。在含有模序是近年来发展的一种测序手段。其酶学部分板、引物的A、G、C、T四个反应管中,DNA聚利用了双脱氧法的原理,但在测序反应体系中,*中国协和医科大学基础医学研究所。51以非放射性标记物(如地高辛、生物素)代替放反应中四种ddNTP终止的DNA片段的标记射性同位素示踪测序反应的产物,最后通过酶物。目前ABI公司的荧光素有两种掺入

6、方式。显色反应显示出测序结果。又如Promega公司第一种是将四种荧光素预先标记在测序反应所推出的银染测序方法,利用较为敏感的银染色用引物的5′端,形成四种标记引物,在测序反来检测序列胶中的DNA条带。这一方法比传应的四支管中,特定荧光标记的引物则与特定统的检测手段快速、安全、费用低廉,成为双脱的ddNTP底物保持对应关系。第二种是将荧氧法序列分析中独具魅力的测序系统。最近又光素连在作为终止底物的ddNTP上,在反应报导了一种使用“链亲和素包裹磁性颗粒”的固中,带荧光发色基团的ddNTP在掺入DNA片[4]相化学测序方法,采用化学发

7、光物1,2-diox-段导致链延伸终止的同时,使该片段3′端标上[5]etane为底物完全代替同位素进行标记。这种了一种特定的荧光素,四种荧光素分别与四种方法是基于生物素-DNA-链亲和素混合物的发ddNTP底物连接,反应结束时产生的四组现。此种混合物在化学测序反应条件下保持稳DNA片段分别由特定ddNTP所终止,且标记定。聚合酶链反应产生的5′-生物素末端首先被有四种不同的荧光发色基团。采用四标记单泳链亲和素磁粒捕捉,室温时在磁粒上发生一系道电泳法分离DNA,一次可读出DNA的长度列化学反应,随后用哌啶分裂,其产物用凝胶电为400

8、-500bp。最近ABI公司又推出了更为高泳分离,转到尼龙膜上,然后对化学发光物检测效的377测序仪。可显示序列结果。由于完全排除了化学物质的而A.L.F采用单种荧光素标记,也有两种污染,又压缩了传统的化学测序方法的沉淀/离标记方法。