高通量测序技术的类型原理及应用

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1、高通量测序技术姓名：赵淑莉学校：吉林大学主要内容类型及原理2应用341概述致谢概述高通量测序技术(High-throughputsequencing)又称“下一代”测序技术”、深度测序以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。类型及原理目前，所说的高通量测序技术主要是指454LifeSciences公司、ABI公司和Illumina公司推出的第二代测序技术以及HelicosHeliscopeTM和PacificBiosciences推出的单分子测序技术。2005年，454LifeSciences公司(

2、现已被Roche公司收购)首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。第二代测序技术原理：酶级联化学发光反应1.首先将PCR扩增的单链DNA与引物杂交，并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。第二代测序技术2.在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。原理：酶级联化学发光反应3.焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光，CCD检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷

3、酸数目成正比。第二代测序技术此后，Illumina公司和ABI公司相继推出了Solexa和SOLiD(supportedoligoligationdetetion)测序技术。第二代测序技术即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。原理：与焦磷酸测序法的类似，核心思想都是边合成边测序(sequencingbysynthesis)。第二代测序技术第二代测序技术优点：操作极为简便：无需进行电泳；可以在芯片上进行高通量分析；大

4、大节省了成本和时间。Illumina公司目前拥有三种测序平台，分别为HiSeq2000、HiSeq1000、GenomeAnalyzerIIx(http://www.illumina.com/)；ABI公司则主要是SOLiD3和SOLiD4两个测序平台。从通量这个最直观的数字看来，HiSeq2000领先于SOLiD4。HiSeq2000测序平台单次反应可以读取200G的数据，而SOLiD4仅为100G左右。第二代测序技术就测序读长来说，454测序平台读长最长，目前已经达到400nt。因此，454平台比较适合对未知基因组从头测序，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa测序读长较45

5、4短，仅为100nt左右，但测序通量高、价位低，适合基因组重测序等。SOLiD读长也较短，但测序精度较高，特别适合SNP检测等。在第二代测序平台不断完善和广泛应用的同时，以对单分子DNA进行非PCR测序为主要特征的更新的测序技术也初显端倪。2008年4月HelicoBioScience公司的Harris等在Science上报道了他们开发的基于全内反射显微镜(totalInternalreflectionmicroscopy,TIRM)的测序技术—单分子测序技术。单分子测序技术基于全内反射显微镜(totalInternalreflectionmicroscopy,TIRM)的测序技术原理：1.将

6、待测DNA样品随机打断成小片段，在每个小片段的末端加上poly-dA；2.将小片段DNA模板与固定在检测芯片上的poly-dT引物进行杂交并精确定位，并逐一加入荧光标记的末端终止子；单分子测序技术3.洗涤、成像，切开荧光染料和抑制基团；4.洗涤、加帽，允许下一个核苷酸的掺入；5.这样通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。单分子实时技术(SMRT)单分子测序技术该技术利用单分子技术和DNA聚合酶，在聚合反应的同时就可以读取测序产物。SMRT测序技术在测序速度、读长和成本方面有着巨大的优势和潜力。IonPGM测序技术原理基于半导体芯片技术，在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次

7、掺入ACGT，随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到。单分子测序技术主要优点：大大节省了成本和时间主要缺点：测序仪的价格昂贵单分子测序技术目前HelicoBioScience公司的HeliScope测序仪售价近百万美元，这是一般实验室和科研单位所不能承受的。LifeTechologies公司推出的IonPersonalGenomeMachine(PGMTM)测序仪价格仅