RNA提取方法及原理AB

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1、RNA提取方法及原理第八组一、研究背景二、方法及原理1、研究背景1.1RNA研究的重要性DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。1.2RNA分布不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏

2、1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mg2、方法及原理2.1RNA的提取流程1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得RNA提取流程－－样品前处理注意点选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉

3、培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融RNA提取流程－－样品前处理中如何保存样本RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒RNA提取流程－－RNA的纯化及获得RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的

4、污染2.2RNA提取的注意事项2.2.1杜绝外源酶的污染一：严格戴好口罩，手套。二：实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。2.2.2阻止内源酶的活性一：选择合适的匀浆方法。二：选择合适的裂解液。三：控制好样品的起始量。2.2.3明确自己的抽提目的一：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。二：RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。2.3Rnase污染的10大来源1：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：实验台面

5、5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶2.4几种RNA提取方法2.4.1TRIzol法TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。TRIzo

6、l法提取流程1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。6．加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，750

7、0g×5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)实验流程图细胞选择贴壁细胞悬浮细胞2.4.2苯酚法细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界

8、面处形成凝胶层。苯酚法提取酵母RNA取1g活性干酵母在研钵中研碎，加10mLSDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管