SDS-PAGE凝胶电泳

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1、蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳一目的掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法二原理SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，

2、这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量三试剂和器材试剂：1低分子量标准蛋白质2待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液）3凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用41mol/l，PH8.8Tris-HCl缓冲液，Tr

3、is121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml510%(w/v)SDS610%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配）7四甲基乙二胺（TEMED）8电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。92×样品稀释液：SDS500mg,巯基乙醇1ml,甘油3ml,溴酚蓝4mg，1mol/LTris-HCL(pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。10

4、固定液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml11脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml12染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽四操作步骤1分离胶制备：凝胶浓度5%7.5%10%12.5%15%凝胶贮液ml57.51012.5151mol/LPH8.8Tris-HClml11.211.211.211.211.2水ml13.711.21.28.73.710%SDSml0.310%过硫酸铵ml0.1TEMED(μL)20将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙

5、中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形成凹槽处处平齐，而后插入“加样梳”，在室温下放置1小时左右，分离胶即可完全凝集。凝聚后，慢慢取出“加样梳”，取出时应防止把加样孔弄破，取出“加样梳”后，在形成的加样孔中加入蒸馏水，冲洗未凝集的丙烯酰胺，倒出加样孔中的蒸馏水后，在加入已稀释的电极缓冲液。2,样品制备：标准蛋白质制备待测蛋白样品制备：液体待测样品，可取500μL，加入等体积的“2×样品稀释液”，混匀，在沸水浴中加热5min,取出，冷却至室温备用。若液体待测样品蛋白质浓度太稀可经浓缩后再制备。3，点样用微量进样针吸取上述蛋白质样品20μL分别加入到各个加样孔中，为了获得准确

6、的结果，每个样品应做两次重复。4，电泳将电泳槽与电泳仪连结，在电泳槽中加入已经稀释的电极缓冲液，打开电源，选择合适电压，保持恒电压300V，进行电泳，直至样品中燃料迁移至离下端1cm处，停止。5，固定，染色，脱色将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。淀粉酶活性电泳浓缩胶（单板）：水：1.8ml凝胶贮液：0.5mlPH6.8缓冲

7、液：0.78ml10%SDS:34μLTEMED:30μL10%AP:25μL上样要少，4μL即可；电泳完毕后，胶用清水冲洗两遍，再用2mol/lTris溶液浸泡1h；蒸馏水洗干净，倒入1%淀粉溶液，震荡水浴锅中，37°反应10min；取出，加入碘-KI（0.2%：2%）溶液显色；灯箱观察拍照。糖电泳电极缓冲液0.09MTris0.08M硼酸2.6mMEDTA胶7.5ml凝胶贮液15ml贮液7.5ml水TEMED60微升10%AP90微升贮液0.2Mtris0.2m硼酸2mmEDTA进样缓冲液4×2M蔗糖（10ml贮液)在实验中,对电泳缓冲系统进行了