《DNA序列分析》课件

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1、第九章DNA序列分析第一节Maxam-Gilbert化学降解法第二节Sanger链终止法第三节DNA片段序列测定的策略第四节核苷酸序列的生物信息分析第一节Maxam-Gilbert化学降解法化学降解法：人们用专一性作用于A、T、G、C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。除了要研究与DNA的高级结构、DNA-蛋白质结构相关性采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，普遍采用后面所讲的酶促合成法。第二节Sang

2、er链终止法1977年Sanger设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。Sanger法获得诺贝尔化学奖。一、Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的

3、位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。二、双脱氧终止法测序反应体系：DNA聚合酶单链DNA模板带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4种ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP)Sanger法DNA测序的试剂①引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构②模板③DNA聚合酶④2’,3’-双脱氧核苷三磷酸（2’,3’-dideoxyn

4、ucleosidetriphosphate,ddNTP）⑤dNTP三、测序反应的种类①引物标记法(Dyeprimerreactions)②终止物标记法(Dyeterminatorreactions)Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3'carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthso

5、flabeledstrandsproducedinthisreaction.Thisfigureisarepresentationofanacrylamidesequencinggel.NoticethatthesequenceofthestrandofDNAcomplementarytothesequencedstrandis5'to3'ACGCCCGAGTAGCCCAGATTwhilethesequenceofthesequencedstrand,5'to3',isAATCTGGGCTACTCGGGCGT测序过程:1.模板与引物杂

6、交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入：DNA聚合酶、dNTPs、标记引物终止剂不同：ddA、ddG、ddC、ddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳：ACGT次序，高压电泳4.放射自显影得到直读图象第三节DNA片段序列测定的策略人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱趋于完成，人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高，大大推进了大规模DNA测序的进程。一、定向测序

7、策略定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析。二、随机测序战略随机测序战略又称鸟枪战略(shotgunstrategy)，此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列。三、多路测序战略多路测序战略(Multiplexmethod)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同

8、时进行电泳及阅读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组DNA。将DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克隆进行测序。四、大规模DNA