《基因敲除与药学》PPT课件

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1、第八章基因工程及其在医药工业中的应用第四节目的基因制备和常用分离方法一、已知基因的获得：（一）人工合成①根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。②适用于合成分子量较小的目的基因（100bp以内）。（二）聚合酶链反应（PCR）P333图8-161、定义：又称基因体外扩增；是在引物的介导下，通过变性、退火、延伸三步循环反应，体外快速的DNA特异性扩增技术。——PCR技术的发明者——DNAReplication:5’3’dATPdGTPdTTPdCTPd

2、TTPdGTPdATPdCTPDNA-pol3’TemplatePrimer5’DNAReplication:3’2、PCR反应原理模拟体内DNA复制过程，通过变性、退火、延伸三步反应的循环完成，靶基因的双链DNA变性为单链，特异的引物在退火过程中与单链DNA模板聚合，在靶DNA的指导下引物的3’末端延伸靶DNA的互补链，完成一个循环。理论上，每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，DNA分子扩增为2n；高温变性：94℃，目的基因接连为单链，以作为扩增的模板；低温复性：55～60℃，一对特异性引物分别与模板3’端互补结合；适温延伸

3、：72℃，延伸反应；55TemplateDNA5Primer15Primer25555The1stcycleThe2ndcycle55555555平台期指数扩增期到达平台期所需PCR循环次数取决于模板拷贝数、PCR扩增效率及DNA聚合酶的种类及活性.3、PCR产物特异性①模板序列：应使用纯度和浓度较高的DNA模板；②引物：优化引物的设计③使用较高的退火温度，较少的循环次数；④使用较低浓度的引物、酶和镁离子；4、PCR反应体系模板：DNA或RNA(逆转录合成cDNA)DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶缓冲

4、液系统：Tris-HCl,KCl,Mg2＋底物：相同浓度的dNTP引物5、PCR的主要用途目的基因的克隆基因的体外突变DNA和RNA的微量分析DNA序列测定基因突变分析PCR仪器设备：自动移液器和枪头微量离心管PCR仪电泳设备SimpleandrapidoperationWideapplicability二、未知基因获得(一)基因组DNA文库：P336图8－17采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因文库”。从基因

5、组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。基因文库（genelibrary）(G-文库)：是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。基因文库含有基因组内全部基因片段，包括外显子和无表达功能的内含子序列。每一个克隆只含有一个基因片段，应用时利用探针，从文库中钓取含有所需目的基因的克隆。（二）cDNA文库将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为cDNA文库。cDNA文库(C-文库)：是以mRNA合成的互补c

6、DNA的随机片段的重组DNA克隆群。cDNA文库不含内含子序列，易于表达。具有组织细胞特异性：不同组织细胞、不同发育阶段，基因表达的情况都不相同，应选择特异表达的细胞及状态；C-文库比G-文库小得多，更容易筛选。第五节载体DNA与目的基因的连接载体的选择（主要考虑以下5个条件）1.有足够容纳目的基因的幅度根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的载体2.构建DNA重组体的目的克隆选克隆载体，表达选表达载体3.载体MSC中的酶切位点根据克隆外源DNA的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型5.载体克隆位

7、点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配DNA分子的体外重组过程示意图一、黏性末端DNA片断的连接：当在载体和目的基因上有相同的限制酶酶切位点时，用同种限制酶（或同尾酶）使二者产生相同的黏性末端，从而将二者连接。同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接GGATCCCCTAGGBamHⅠ的识别序列及切割部位GGATCCCCTAGGBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGCCTAG5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'GGATCCCCTAGGGATCCG目的基因片段混合、退火GCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAG质粒

8、载体含目的基因的重组质粒GCCTAGGATCCGDNA连接酶1、插入失活法（单酶切）将外源目的基因插入载体选择性标记处，并使其失活。P340图8－20质粒pBR322的抗性基因筛选示意图插入失活示意图2、定向克隆法（双酶切）为实现定向