《干细胞技术服务》PPT课件

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1、干细胞产品技术服务OricellTMOricellTM最新产品：1.ES成神经元分化试剂盒；2.ES成心肌分化试剂盒；3.ES成肝实质细胞分化试剂盒；4.MSC成肝实质细胞分化试剂盒；5.NSC成神经元分化试剂盒；6.NSC成星型胶质细胞分化试剂盒；目录：胚胎干细胞培养和技术介绍成体干细胞的常见问题与解决方案1.细胞和培养（干细胞、原代细胞产品和试剂）2.细胞分化（多个方向的标准方法）3.细胞示踪（GFP/RFP和定制方法）干细胞冻存和复苏方案干细胞应用技术Stemcell间充质干细胞（MSC）MesenchymalStemCells是一种多能干细胞；胚胎干细胞（ES

2、）EmbryonicStemCells是一种全能的干细胞神经干细胞（NSC）NeuralStemcell是一种神经系统的多能干细胞Primarycell神经元系统（多个来源和物种，海马、皮层）星型胶质细胞（多个物种皮层）肝实质细胞；肝脏前体细胞；分离其他客户定制细胞；胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonicstemcellES,细胞)是指胚泡期的内细胞团中分离出的尚未分化的、能在体外培养、具有发育全能性的早期胚胎细胞无限增殖、自我更新可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型ES细胞的来源：5d胚胎ABCDES生长特性鼠：生长快，胰酶消化，2天传一次，可一传多

3、。复苏率较高。人：生长慢，机械分离，7~10天传一次，相对较少。1:4~1:6。复苏率低。表面抗原的表达Oct-4：一种转录因子，发育全能性的标志。碱性磷酸酶（AKP）：常被用来作为鉴定ES细胞及其分化与否的重要标志。SSEA-1：小鼠ES表达SSEA-3、SSEA-4：人ES表达染色体结构核型分析：正常稳定的二倍体核型。不随传代次数而改变。46，XX；46，XY核型检测：46，XX多能性和全能性体内：畸胎瘤实验特定抗拟胚体特定条件诱体免疫导/自然分化组化体外分化去除饲养层细胞全能性体内：畸胎瘤实验体外：去除饲养层细胞拟胚体（EB,embryoidbody。为ES细胞

4、悬浮生长自发分化形成,含有内中外三个胚层组织,能基本上模拟体内的发育过程)；贴壁诱导；特定条件诱导/自然分化（除去LIF）各胚层特定抗体免疫组化检测体内：畸胎瘤检测血管组织呼吸道上皮鳞状上皮腺体组织脂肪组织体内分化外胚层：鳞状上皮、神经组织等中胚层：骨和软骨、横纹肌、骨骼肌、血细胞和骨髓细胞等内胚层：柱状上皮、肠管样组织等体外：分化形态ES贴壁诱导EB约5~7天后出现自主性搏动129MouseHumanES免疫组化检测Nestin(ectoderm)Troponin(mesoderm)Tubulin(ectoderm)AFP(endoderm)神经分化：贴壁诱导第2天

5、神经分化：贴壁诱导第5天IHC β‐3 Tublin特异性抗原的表达情况抗原人ES鼠ESOct-4++Nanog++SSEA-1ˉ+SSEA-3+ˉSSEA-4+ˉ不断有新的蛋白标记被发现和论证碱性磷酸酶染色小鼠ES流式图染色体结构核型分析：正常稳定的二倍体核型。不随传代次数而改变。人（46，XX），鼠（40，XY)性别分析性别通过PCR的方法鉴定，目的基因是基因组DNA的Y染色体相关基因Tspy，阳性对照用X染色体相关基因PolA1以及Gapdh。ESClonemES-GFPHumanES-GFPMEF细胞：ES成功的一个重要因素Cyagen提供的MEF经过γ-ir

6、radiation处理，确保所有的细胞都完全失去增殖能力，又可以保证最佳支持和分泌能力，同时没有任何化学有毒物质的污染，为你ES细胞提供最佳的生长环境；为ES的增殖提供多种因子；实验室的调查普遍结果：据Cyagen对多个实验室使用的53个ES细胞的样品进行检测，45%被支原体污染；没有严格质量控制和环境控制的情况下制作的MEF：有35%以上是携带支原体，这个数据还根据操作技术不成熟，使用动物污染严重情况，风险也会大大的增加；丝裂霉素‐C（MITOMYCIN C）：A、长期接触丝裂霉素‐C，药物毒性将严重影响操作人员的身体健康；（单位量10‐30ug/ml处理20个10

7、cm dish需要3‐6mg）B、丝裂霉素‐C溶液的不稳定，4℃保存，也会快速降解，导致处理的细胞不能完全失活，这将严重影响后面实验分析；C、丝裂霉素‐C的残留，微量的丝裂霉素‐C也会造成ES细胞增殖抑制和分化；（因为其是细胞内DNA结合剂）OCT-4(+)SSEA-1(-)SSEA-4(+)AAABBBCCCEs细胞培养的过程：如何准备状态良好的MEF细胞；消化传代过程；如何去除MEF细胞；挑克隆的操作；如何准备用于进行各种基因操作的细胞；如何准备用于进行注射的细胞；如何准备状态良好的MEF细胞；取胚胎（13.5d）：去除头部和四肢；剪碎后加入0.