液相色谱柱的选择与使用

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1、液相色谱柱的选择与使用液相色谱柱的选择与使用目录°一、液相色谱柱的选择°1、分离模式的选择°2、C-18柱的性能影响因素°3、保留值与pH的关系°二、液相色谱柱的安装°1、液相色谱柱的结构°2、色谱柱的安装°三、液相色谱柱的使用°1、样品的前处理°2、流动相的配制°3、色谱柱的平衡°4、流动相流速的选择°四、分析条件调整的影响°五、液相色谱柱的维护色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理色谱柱高压泵检测器色谱工作站进样器液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。一、液相色

2、谱柱的选择用硅胶的正相模式°1、分离模式的选择溶于正己烷用键合相的正相模式溶于甲醇或甲醇/水溶于有机溶剂用键合相的反相模式或乙腈或乙腈/水用键合相的反相模式分子量<2,000溶于四氢呋喃低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式溶于水非离子化抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相模式样品离子化用硅胶的正相模式离子交换模式溶于有机溶剂凝胶渗透色谱分子量>2,000凝胶过滤色谱溶于水大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式正相&反相色谱°正相吸附色谱极性:固定相>流动相固定相-极性正相色谱流动相(己烷,庚烷)-非极性20%极性物质后出峰反相色谱80%反相分配色谱极性:固定相<流动相固定相-非极性流动

3、相(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-极性非极性物质后出峰柱填料基质高或低pH下,硅胶会溶解•硅胶基质-pH3~8化学修饰困难•AlO.nHO-pH1~14232孔结构复杂,孔径不均匀，导•聚合物基质-pH1~14致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损2、C-18柱的性能影响因素：•硅胶纯度物理性质•色谱柱尺寸•颗粒形状•粒径•表面积•键合类型化学性质•碳覆盖率•孔径•封端C-18柱的性能影响因素：色谱柱物理性质硅胶纯度•填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸•填料床的长度和内径颗粒形状•球型或不规则型粒径•平均颗粒直径,通常3-10µm表面积•颗粒外表面和内部孔表面的总和,

4、以m2/gram表示孔径•颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300ÅC-18柱的性能影响因素：硅胶纯度（以安捷伦柱为例）A类硅胶B类硅胶(高纯)OriginalZORBAXSIL(1970s)ZORBAXRx-Sil(1987)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表由于金属含量低,硅羟基pKa高,面上金属含量高(硅羟基的pKa低),碱性化合物不发生拖尾导致碱性化合物发生拖尾金属浓度（ppm)二氧化硅NaKMgAlCaTiFeZrCuCrZnZorbaxRx-SIL10<341.52nd3ndndnd1ZorbaxSIL17ndnd579322188<1nd88Nucleosil56N/AN/And1

5、305776ndN/AN/AndHypersil2900N/A403003865230N/AN/AN/AN/And=未检出ZorbaxRx-SIL:11种金属<35ppm(未检出其他杂质,<1ppm);99.995%纯度的二氧化硅C-18柱的性能影响因素：柱尺寸色谱柱尺寸对色谱分离的影响：•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长•窄径柱(≤2.1mm)-检测器灵敏度高•宽径柱(3-21.2mm)-载样量高C-18柱的性能影响因素：颗粒形状与大小颗粒形状---对色谱分离的影响当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:HO2时,球型颗粒可降

6、低柱压,延长色谱柱寿命球形不规则形粒径---对色谱分离的影响较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5µm的粒径1.8µm3.5µm5µm7µm10µmC-18柱的性能影响因素：表面积与孔径表面积---对色谱分离的影响高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力,柱容量和分离度.表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要孔径---对色谱分离的影响大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品MW≤4,000,选择80Å的孔径样品MW>4,000,选择300Å的孔径大孔径填料适用于

7、大分子分析°大孔径300Å全多孔色谱柱°可用于分离蛋白质和多肽°分子量虽小但hydrodynamicvolume(水动力学体积)较大的分子°Poroshell色谱柱°高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配300Å孔径可改善蛋白质和多肽峰形选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形孔径,分子量对峰宽的影响(梯度分离)0.