荧光定量PCR产品研发规程

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1、荧光定量PCR产品研发规程1．研发产品立项依据（项目可行性报告）：(1)需要检测的病原体是病毒还是细菌、真菌等其它病原体，致病菌是一种病原体或者是几种病原体。如果是针对病毒的检测，需要了解病毒的亚型和基因分型的标准。如果是针对基因的检测，需要检测的基因有哪些。(2)病原体的分类位置情况，病原体的感染和致病机制，病原体的生活史。(3)现有病原体检测的方法，各自的优劣，什么方法是目前认可的金标准，荧光定量PCR的优势。(4)病原体检测或诊断的临床意义，什么类型的样品最适合的样品，有多少适合检测的样品类型。(5)国内外同类产品情况：什么公司有同类的产品，

2、有多少公司有该产品，占市场主导地位的是哪家公司的产品？技术原理和技术优势、质量标准和适用的检测样品类型，包装规格和说明书信息，其产品的市场反应情况，是否有有批文的产品。(6)市场需求情况（可由公司市场销售人员进行调研）(7)临床标本获得情况（是否可以得到阳性标本，从哪里得到临床样品，阳性样品量是否足够）(8)SFDA报批的可能性（从生检所了解）(9)参比品（从生检所了解）：参比品主要是特异性参比品、敏感性参比品和最低检出量标准品。是否有国家标准品。(10)技术方法的文献资料：l主要是有无特异性的引物和探针序列，基因组片段，基因组序列。确定引物和探针

3、序列以及在基因组上的具体位置。lQ-PCR（RT-QPCR，复合Q-PCR）扩增体系，扩增片断大小，探针类型和荧光标记类型。l检测灵敏性，进行灵敏度检测的质控品及其制备，最低检出率。l检测特异性，特异性检测的参考品极其参考品的范围。l可以检测的临床样品类型l针对不同种类临床样品的处理方法。2．产品研制技术路线(1)基因组序列和序列比较：查找病原体的基因组序列，对于病毒检测，需要分析比对病毒亚型的基因组序列。对于基因检测，需要查找相关基因组序列。（2）扩增引物与探针的选择：根据文献资料和基因组序列，核实引物序列和探针序列，或者根据现有基因组序列，设计

4、至少三种引物和探针组合，选择荧光染料和淬灭分子类型。(2)合成引物和探针需要了解不同引物厂家的引物合成质量，包括价格，国内从事DNA合成的厂家很多，一般的PCR扩增引物都可以满足实验要求，但更应该关注荧光标记探针的质量。(3)阳性质控品的制备利用阳性标本的PCR扩增产物来制备强阳性质控品（1x106拷贝/ul）和临界阳性质控品（1x102拷贝/ul）。(4)利用实验用水作阴性质控品(5)阳性标本和阴性标本的选择：确认阴、阳性样品的金标准。(6)主要原材料的选择、制备：TaqDNApolymerase制备或选择,引物合成，探针的标记制备。(7)建立荧

5、光定量PCR扩增系统：确定扩增反应的体积，4xdNTP终浓度，引物浓度，探针浓度，MgCl2浓度，TaqDNApolymerase用量。(8)引物探针组合的选择和参数优化：利用低拷贝阳性质控品来验证引物特别是探针的质量和效果。调整PCR扩增参数，包括扩增系统的检测灵敏度，需要验证荧光信号的强度，荧光信号的曲线状态。根据实验结果选择一个最好的引物探针组合。(9)最低检出量的测定利用系列稀释的阳性定量标准品来确定荧光PCR的最低检出量。最好用国家标准或者接近病原体的阳性自制定量标准品来确定最低检出量。必要时可以利用利用现有的一些手段来调节PCR系统以便

6、提高PCR检测的灵敏度。(10)阳性、阴性参考品的选择与研制：利用金标准（国家标准品、或用有批文的同类产品或者其它被认可的检测手段）来选择阳性参考品和阴性参考品，测定荧光定量PCR试剂盒的检测特异性。(11)检测特异性测定：利用选择的阴性参考品（阴性标本）来检测特异性。无该病受检者检出的阴性例数检测特异性（100%）=x100%无该病受检者的总例数(12)检测敏感性测定：利用选择的阳性参考品（阳性标本）来检测敏感性。已知患该病检出的阳性例数检测灵敏度（100%）=x100%已知患该病检出的总例数(2)样品处理方法的选择和建立利用阳性临床样品来验证样

7、品处理方法的简便性、稳定性和核酸提取的质量（纯度和得率）。(3)测定精密性：针对同一阳性质控品和阳性样品连续检测十次，CV值<15%(4)试剂盒稳定性试验，即把试剂盒放在37℃破坏3天后，与未破坏的试剂盒同时检测，测试试剂盒稳定性。3．参考值（参考范围）确定4．制定产品质量标准和质量检测的SOP5．生产SOP编写4.按SOP生产工艺生产三批，编制生产纪录。5.自我质量检验，编制质量检验纪录6．产品性能评估等相关工作l分析性能：包括分析灵敏度、分析特异性、测定范围、测定准确性、批内不精密度、批间不精密度等。l临床性能：临床性能主要包括临床灵敏度、临床

8、特异性等。临床性能评估应通过临床试验，临床研究总样本数至少为500例。一般上要做1000例。临床试验由申请人在提出注册申请