《活性测定》PPT课件

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1、实验八血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定——改良赖氏法【实验目的】掌握改良赖氏法测定ALT的原理、注意事项和临床意义，熟悉标准曲线的绘制。【实验原理】1、催化反应ALT催化谷氨酸与丙酮酸间的氨基移换反应：L-丙氨酸α-酮戊二酸α-丙酮酸L-谷氨酸H2、显色反应草黄色棕红色注意：α-酮戊二酸也与2，4-二硝基苯肼反应产生苯腙，但两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500~520nm差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍。据此特点，可计算出丙酮酸的生成量。【操作步骤】（一）样品准备：样品为空腹血清、血浆（肝素抗

2、凝，0.1mg肝素可抗凝1.0ml血液；EDTA抗凝，1.8mgEDTA可抗凝1.0ml血液）。样品应在低温条件下运输保存，样品中ALT在2～8℃可稳定7天。（二）标准曲线绘制：加入试剂（μl）01234pH7.4PBS100100100100100丙酮酸标准液050100150200底物缓冲液5004504003503002，4-二硝基苯肼500500500500500混匀，置37℃恒温20分钟氢氧化钠50005000500050005000相当于酶活力KarU—285797150酶活力（U／L）—50109209406A505ΔA(An-

3、A0)混匀后，室温10分钟，505nm波长，以蒸馏水校正零点，读取各管的吸光度值，制作工作曲线。（三）血清酶活性测定取2支试管，按下表操作加入试剂（u1）空白管（B）测定管（U）血清—100pH7.4PBS100—底物缓冲液500500混匀，置37℃恒温30分钟2，4—二硝基苯肼500500混匀，置37℃恒温20分钟氢氧化钠50005000A505ΔAU(Au-AB)混匀后，室温10分钟，505nm波长，以蒸馏水调零点，读取测定管的吸光度值。【实验结果】（一）绘制标准曲线图以ΔA为纵坐标，以相当于酶活力（KarU）为横坐标，利用标准曲线绘制的

4、数值在坐标纸上制作标准曲线。先描散点图，然后用光滑的细线连接各点。（二）待测血清结果读取1、求ΔAU值：ΔAU=AU-AB2、结果读取：在标准曲线上找到相应的点，读取横坐标的数值，即为待测血清ALT酶活性。（三）卡门氏单位（KarU）定义：KarU单位为分光光度单位，lml血清在25℃、反应液总体积3ml、波长340nm、光径1.0cm时，每分钟吸光度下降0.001A为1个单位。【参考值】0~25KarU或0～40U／L（37℃）【注意事项】1．酶活力大于150KarU或406U／L(37℃)，应将样品用蒸馏水适当稀释后测定，结果乘以稀释倍数

5、。2．反应温度和时间必须严格按照操作规程进行控制。3．如遇黄疸、溶血或乳糜标本时应作样品空白。4．试剂变混浊或空白吸光度值超出0.220—0.290范围应弃去。5．试剂在2～8℃密闭避光贮存可稳定12个月。6.加入2，4–二硝基苯肼溶液的作用：①终止酶促反应。②显色反应。【临床意义】1．ALT活性在下列疾病可见增高：（1）肝胆疾病：传染性肝炎、肝癌、肝硬变活动期、中毒性肝炎、脂肪肝、胆管炎和胆囊炎等。（2）心血管疾病：心肌梗塞、心肌炎、心力衰竭时的肝脏淤血、脑出血等。（3）骨骼疾病、多发性肌炎、肌营养不良等。2．一些药物和毒物可引起ALT活性

6、升高：如氯丙嗪、异菸肼、奎宁、水扬酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等。【方法学评价】本法重复性、准确性、试剂稳定性较差，但操作简便，实验条件要求不高，便于基层医疗单位开展。