《疫荧光技术》PPT课件

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1、免疫荧光技术威斯腾生物技术中心威斯腾生物成立12周年庆主要内容技术原理1实验流程2注意事项3常见问题4免疫荧光技术(immunofluorescence)技术原理将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。根据实验方法分类：直接法间接法补体法其他补体法：利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光。其他免疫荧光技术：时间分辨免疫荧光分

2、析荧光偏振免疫分析技术时间分辨免疫荧光测定时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。荧光偏振免疫分析技术荧光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强

3、弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关。FPIA最适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素的测定。激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以

4、用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量,配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。荧光显微镜的不足之处：1、无法实现对荧光、透射光的同时采集，无法实现多重荧光的同时采集和共定位。2、荧光的散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3、荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4、无法对样品进行断层扫描，完成3D的工作。5、滤镜对荧光信号衰减大，灵敏度和荧光强度不够。6、可以观察活细胞和组织，但是细胞或组织内机构高度重叠。7、只能在二维坏境下观察。8、样品不能太厚。9、放大倍率小。荧光常见基础术语：荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射

5、光长的光线，即荧光。受激发后能产生荧光的物质称为荧光物质或荧光素。激发光：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI，DAPI）、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）。自发荧光：组织和细胞中某些成分受激发时可发出荧光，即自发荧光。漂白：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失，即漂白现象。多激光器系统（多通道激光检测）：在可见光范围内使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红HeNe（R）

6、激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光(fluoresceinisothiocyanate,FITC)FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色

7、。四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。酶作用后产生荧光的