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1、离子交换层析概述：用于生物大分子物质如酶、蛋白质、多肽、核酸、寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖的分离和纯化。特点：⑴具有开放性支持骨架⑵具亲水性⑶多孔性.离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。一.离子交换剂:在惰性载体上引入(以共价结合的方式)带有电荷的活性基团.1.按其带电荷的功能基团分类(1)阳离子交换剂:载体上带有负电荷的功能基团,能结合溶液中的正电荷.(2)阴离子交换剂:载体上带有正电荷的功能基团,能结合溶液中的负电荷.2.按其载体分
2、类(1)离子交换树脂:主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂.聚苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成一网状结构.交联剂:二乙烯苯二乙烯苯交联度=————————×100%苯乙烯+二乙烯苯苯乙烯和二乙烯苯混合成不同的比例就可获得不同交联度的树脂.二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大,获得的树脂交联度就越大.交联度大的树脂结构紧密、孔隙小,大分子量的离子就不能进入树脂颗粒内发生离子交换.交联度的范围从1%～16%树脂所含的交换基团性质分为两类:a.阳离子交换树脂:能与溶液中阳离子交换,树脂带负电荷.b.阴离子交换树脂:能与溶液中阴离子交换,树脂带正电荷.根据阳离子和阴离
3、子交换树脂中功能基团的酸碱解离程度分为强、弱两种:(a)强酸型阳离子交换树脂:主要以磺酸基(R-SO3)为功能基团,它的解离不受外界溶液的影响.典型的交换方程式:RSO3H+NaCl→RSO3Na+HCl(b)弱酸型阳离子交换树脂:功能基团为羧基(-COOH)、酚羟基等,它们解离程度小,交换性能和溶液的pH有关,在酸性溶液中无交换作用.典型交换方程式:RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O(c)强碱型阴离子交换树脂:功能基团含三甲胺的称为强碱I型,含二甲基乙醇胺称为强碱II型.pH条件都不受限制.典型交换方程式:RN(CH3)3+NaOH→RN(C
4、H3)3OH+NaCl(d)弱碱型阴离子交换树脂以伯胺基(-NH)、仲胺基(＝NH)、叔胺基(≡N)或吡啶基为功能基团,交换能力随溶液的pH条件而变化,pH越低交换能力越强.典型交换方程式:RNH3OH+HCl→RNH3Cl+H2O离子交换树脂指标:交联度、交换容量a.交联度:交联剂所占的百分比称为交联度.范围从1%～16%.交联度小,分子结构较疏松,孔径大适用于分离分子量较大的离子性物质.交联度大,孔径小适用分离分子量小的物质.目数：离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为20-50目20840m50297m100149m（代表二乙烯苯的百分
5、含量）b.交换容量:指树脂能进行交换的能力,主要决定于树脂网状结构内所含的碱性或酸性基团的数目.以mmol/ml或mmol/g表之.(2)纤维素离子交换剂:在纤维素分子结构上连接一定的离子交换基团就成为离子交换纤维素.(3)离子交换凝胶—分离大分子物质如:葡聚糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂、聚丙烯酰胺离子交换剂.二.原理离子交换层析是以离子交换剂(具有离子交换性能的物质)作为固定相,利用它与流动相(洗脱剂)中的离子能进行可逆交换的性质,来分离离子型化合物的一种方法.即溶液中的离子与离子交换剂上的功能基团交换反应的过程.离子交换过程示意：起始吸附解吸完成
6、x+:起始缓冲离子y+：待分离离子z+：待分离离子带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来;带电荷量多,亲和力大的后被洗脱下来.三.操作注意点:1.离子交换剂的选择:选择原则:根据被分离物质的性质选择—同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异大的型号的交换剂.考虑因素:1.被分离物质所带的电荷.2.被分离物质分子的大小.3.被分离物质所处的环境.4.被分离物质的物理化学性质.5.被分离物质的大概数量.(二)缓冲液的选择:原则:不能发生化学反应,避免使样品发生变性.考虑因素:1.被分离物质的稳定性.蛋白质的大分子物质在层析时不发生变性.2.在此
7、缓冲溶液的pH条件下,被分离物质所带的电荷性质与交换剂上的平衡离子相等.3.离子交换剂的性质.避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换,引起pH变化,降低交换容量.4.缓冲液必须不影响被分离物质的测定.(三)洗脱剂的选择:原则:所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团,改变溶液的pH或离子强度增强洗脱液与离子交换剂的结和力降低待分离物与离子交换剂的结合力洗脱方式:梯度洗脱离子交换层析分离氨基酸及其测定(一)原理氨基酸是两性电解质，各有一定的等电点（pI）。在溶液pH小于其pI值时均带正电荷，反之则带负电荷。本实验所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液，分别属
8、于酸性氨基酸（pI2.97）和碱性氨基酸（pI9.74）。在pH4.2柠檬酸钠缓冲液中，天冬氨
