《蛋白组学》PPT课件

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1、第三章蛋白质组与蛋白质组学第一节蛋白质组与蛋白质组学的定义蛋白质组protein+genomeproteome一种基因组所表达的全部蛋白质一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质蛋白质组学阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律一、蛋白质组与蛋白质组学的定义蛋白质组学研究意义和背景目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析等，都是从细胞中mRNA的角度来

2、考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，DNAmRNA蛋白质转录水平调控翻译水平调控翻译后修饰蛋白质的亚细胞定位蛋白质之间的互相作用蛋白质组学的研究意义和背景DNAmRNA蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态蛋白质相互作用温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂的调控蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。（全蛋白组的研究）另一种策略可称为“功能法”，即研

3、究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。（差异表达的蛋白质组）蛋白质组学研究的策略蛋白质组学研究的范围蛋白质的表达模式蛋白质翻译后修饰研究蛋白质-蛋白质相互作用的研究二、蛋白质组学的研究方法差异蛋白组学生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它

4、实验的进一步验证蛋白信息的初步获得第一步、蛋白质分离蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。PelletandextractsupernatantSonicateinlysisbuffer样品制备要求：重复性好蛋白质损失少无核酸去除高丰度或无关蛋白浓度以肿瘤蛋白质组学研究为例说明肿瘤蛋白质的来源（1）以肿瘤细胞为研究材料不同的肿瘤细胞；正常细胞与癌变细胞优点:易获得缺点:这些细胞系从组织中分离出来并经体外培养后蛋白质会发生许多变化（2）外科手术切除的肿瘤组织优点:来源较为方便缺

5、点:整个组织包括基质，纤维原细胞，免疫细胞等，组织匀浆困难，不易分离总蛋白而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。（3）以激光捕获显微切割（LCM）肿瘤细胞LCM是直接从冰冻或石蜡包埋肿瘤组织切片中获取细胞。它是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目的细胞留在膜上。优点：能准确切取肿瘤细胞缺点：需昂贵的仪器第二步、蛋白质的分离二维色谱毛细管电泳双向电泳(2DE)EttanDALTsixEttan™IPGphorIEFunit2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中

6、分离复杂蛋白质混合物的首选技术。大鼠肝线粒体蛋白质组图谱1、双向凝胶电泳(2DE)第一向:等电聚焦（IEF）第二向:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）Ettan™IPGphorIEFunitEttanDALTsix等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线形pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。pH3pH10+-----+-+++-+-+++++Time0+------++++-++++++++----++-+Time1-+Time2SDS-PAGE电泳是根据SDS和还原试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的

7、pH缓冲系统中的分离。2、2DDIGE2D-DIGE差异凝胶电泳技术(differencegelelectrophoresis,DIGE),其可以将三个样品用Cy2、Cy3、Cy5染料染色后，等量混合，在同一块胶上进行双向电泳分离，这样可以降低胶条和操作带来的误差。15min,4CinthedarkQuenchwithlysine30min,4CinthedarkAdddyetoprotein400pmoldyeper50mgproteinReconstitutethedyesSeparateby2D-PAGEPooledinternal

8、standardLabelwithCy2Proteinextract2LabelwithCy5Proteinextract1LabelwithCy3MixlabelledsamplesVolu