《表达序列分析》PPT课件

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1、第六章表达序列分析第一节引言(二)什么是表达序列标签?（expressedsequencetag,EST）从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5′末端或3′末端进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。基因组表达为RNA的序列:mRNA和功能RNA一、表达序列与表达序列标签(一)什么是表达序列?EST的获得途径二、EST的用途基因组物理图谱的绘制基因识别的验证基因表达谱的构建发现新基因电子PCR克隆SNP（singlenucleotidepolymorphism）发现(一)ESTs与基因图谱的绘制基因组物理图谱的构

2、建:借助序列标签位点（sequence-taggedsites，STS）●物理图谱也称为STS图谱●EST是一种STS●1995发表的人类基因组物理图谱含有15086个STS,其中大多数为EST,平均密度为1个标记/199kb(二)ESTs与基因预测的验证某一个物种的基因组测序完成之后，首要任务是对基因组所包含的全部基因进行预测，而现有基因预测软件不能百分之百准确预测全部基因，此时需要对预测基因进行验证，每一条EST代表特定基因的部分序列，因此将预测基因同物种所有的EST进行比对，有助于基因预测的验证。(三)ESTs与基因预测（Blast数据库搜

3、索）在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs)已知基因的不同剪切模式的搜寻(四)ESTs与SNP位点预测来自不同个体的冗余的ESTs可用于发现基因组中转录区域存在的SNPs。应注意区别真正的SNPs和由于测序错误而引起的本身不存在的SNPs。解决这一问题可以通过：●提高ESTs分析的准确性●对所发现的SNPs进行实验验证(五)ESTs与基因表达谱的构建….….Clone反转录（可选）读取光密度聚类分析（非同源功能注释）标记杂交反转录EST分析………….………….………….GeneChi

4、p0.10.060.050.04…000.070.01…表达量矩阵G1,G3,G5G2,G4G6,G9…利用EST，SAGE分析结果制作芯片（研究已发现的基因）连接，转化Ricegenome-wideDNAchip(60,000+预测基因)果蝇基因芯片…原位合成(六)EST数据的不足ESTs很短，没有给出完整的表达序列；低丰度表达基因不易获得（SAGE可以解决）;由于只是一轮测序结果，出错率达2%～5%；有时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或是基因组DNA的污染；有时出现镶嵌克隆；序列的冗余，导致所需要处理的数据量很大。第二节EST数据

5、分析一、cDNA文库的构建与EST数据的实验获取非标准化cDNA文库的构建标准化cDNA文库的构建（杂交方法如扣除杂交）cDNA逆转录引物检测低丰度表达基因不能用于表达谱研究适用于表达谱研究测序成本较高OligoT引物随机引物EST技术流程体内：翻译体外研究：反转录连接，转化文库构建技术已经成熟大数据量分析理念已经形成二、EST数据库1993年前：EST收录于GenBank，EBI和DDBJ1993年NCBI建立dbEST常用的EST数据库数据库名称网址说明dbESThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/综合UniG

6、enehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene综合GeneIndiceshttp://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/综合（一）dbEST（databaseofEST）Genbank的一部分63,236,621条数据（20091016）描述：向dbEST提交数据按格式编辑数据通过E-mail提交更新数据dbEST数据格式Publication文件：文献文件，文献发表信息Library文件：文库文件，实验信息Contact文件：联系人文件，联系信息EST文件：EST数据文件，核心数据在dbES

7、T中检索数据利用Entrez检索系统登录NCBIFTP下载：ftp.ncbi.nih.gov/repository/dbEST例：在Entrez中检索人类血红蛋白EST数据1.检索栏内输入关键词，如“HBBHuman”2.检索结果访问号数据描述Gi号/数据库来源3.检索结果的解读数据记录的编号：DN991377数据记录的描述：……数据记录的格式：Genbank格式、EST格式数据记录的下载：下载FASTA格式序列、下载Genbank格式的文本文件（二）UniGene数据库Genbank的一部分一条纪录为一个genecluster简介查询UniGe

8、ne通过NCBIFtp下载：ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/UniGene/使用dbEST数据库检索