显微技术试验报告

《显微技术试验报告》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、女贞叶片石蜡切片的制作一、实验目的1.掌握石蜡制片的基本方法；2.观察及判断女贞叶片细胞组织的形态变化的主要方法，掌握其各时期结构特点、选材方法；3.了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤。二、实验原理自然状态下活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构。所以研究中多数动、植物材料都必须经过固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤处理，将组织分离成单个细胞或薄片，才能清晰辨认其形态结构。切片法，是材料经过一系列特殊的处理，利用刃具将组织切成极薄的片层，经过固定、脱水、包埋、切

2、片、染色等较繁复步骤，最终制成切片的方法。根据各种不同材料的性质要求进行合理选择处理方法。非切片法的操作比较简单，能保持细胞的完整，但是细胞之间的正常位置移动无法反映细胞之间的正常联系。切片法虽工序繁琐最能保持细胞间的正常的相互关系，能长期完好地保留细胞的原貌，是制作永久性显微切片标本主要方法。石蜡渗入组织块的内部起支持作用并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，获得良好的制片效果。石蜡有其独特的优点：石蜡能切出极薄的蜡片（2～10μm）；切片时能连成蜡带，便于制作连续切片；操作较容易，组织块可以包埋在石蜡中长期保存。但处理中常引起组织部分收缩，切片时受温度、湿度影响较大

3、。三、实验仪器、材料和试剂1.仪器：荧光显微镜、普通显微镜、石蜡包埋工具、恒温箱、包埋箱(熔蜡箱)、旋转切片机、卧式染色缸、载玻片（76×26mm，T=1-1.2mm）、方形盖玻片、电热温台、毛笔、石蜡容器、烧杯、滴管、玻璃板、吸水纸、石蜡2.材料：校园内的幼嫩的女贞叶片3.试剂：无水乙醇、甲醛、等级乙醇、蒸馏水、二甲苯、氯仿、冰醋酸、石蜡、甘油、苯、加拿大树胶、固定液、染色剂、1%番红水溶液、0.1%固绿酒精溶液四、方法步骤1.选材取材采取标本前，要根据制片的要求，选择并配制固定液。研究女贞叶片正常结构选择健全而具有代表性的部位取材新鲜便于固定剂迅速渗入内部取材时要详细记录日期、

4、采集地点、标本名称、时期、取材部位、断面和固定液等。取材后应立即投入固定液，以防女贞叶片组织自溶和腐败。用锐利刀片将女贞叶片快速准确切割成所需的大小，切勿拉锯式的来回切取，轻轻镊取放入固定液中，切取组织大小一般为5mm×5mm，不易超过1cm2。2.固定在一定时间内，组织和细胞离开机体后仍然延续着生命活动。为了防止标本发生病理变化，保持原有的形状和结构，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。固定剂的作用于细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来，从而保存细胞的各种组成成分、形态和结构。固定剂会使柔软组织适当硬化而

5、不易变形，便于随后的处理，改变细胞内部的折光率并助染某些难于染色部位，使细胞结构变得清晰并易于保存。将切取好的新鲜女贞叶片，与临用前配制的卡诺氏液以1：20的比例加入固定时间为12-24小时。本植物材料表面有毛茸或其它不易穿透的物质，则可用含有酒精的固定液固定。材料投入固定液后含有气泡，将气泡抽出，使材料下沉。卡诺氏液中纯酒精固定细胞质，冰醋酸固定染色质，二者穿透力强并能防止组织由酒精引起的高度收缩与硬化。3.浸洗、染色固定完毕后，将材料从固定液中取出冲洗用70%酒精洗掉固定液，经50%、30%酒精复水至蒸馏水中，各级1小时，再入苯胺番红溶液中整染48小时。必须冲洗至其中含有的固定

6、液全部除去，否则妨碍染色和保存。本实验的卡诺氏液是用95%的酒精溶性固定剂要用相同浓度的酒精冲洗。4.脱水植物组织中含有大量的水分，水石蜡是不相溶致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽。脱水剂必须能与水以任何比例相混合。非石蜡溶剂乙醇、丙酮脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋。乙醇因价格便宜，易于得到而被广泛作为脱水剂。为了避免剧烈的扩散引起的组织收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行。将女贞叶片组织放入盖瓶中从30%乙醇开始，经过30%、50%、70%、85%、95%、100%无水乙醇至完全脱水，各级乙醇中放置时间为30min。对于一些柔软的组织应从1

7、5%开始。如果中间须停顿，应使材料停留在70%乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长。脱水必须在有盖瓶中进行防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。5.透明透明剂能与脱水剂相溶又能与包埋剂相溶的特性使组织中的酒精被透明剂替代，石蜡能很顺利的进入组织中并增强组织的折光系数。二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬。将女贞叶片组织块先经过纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯透明