专题四-核酸鉴定技术

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1、核酸鉴定技术专题四鉴定的内容浓度和纯度单一性构型目的分子序列主要内容核酸的物理化学性质核酸的大小核酸的构型常规核酸的电泳检测技术核酸分子杂交鉴定技术经典DNA序列分析技术核酸的物理化学性质紫外吸收：260nm大小：从几个到1011nt构型：超螺旋，解旋序列：功能：核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光率（Absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲

2、线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定性及定量测定。PurityofDNAA260/A280:dsDNA--1.8pureRNA--2.0DNA或RNA纯度的测定对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值来确定，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有蛋白及苯酚等，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作准确的定量测定。对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中

3、核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg／mL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。通常以1OD值（260nm）相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单螺旋DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。1.84通常，含量：1OD260nm=50mg/ml双链DNA纯度：OD260nm/OD280nm=1.8IfOD260nm/OD280nm<1.8，Contaminatedby?IfOD260nm/OD280nm>1.8，Contaminat

4、edby?核酸的大小生物基因组的大小显花类两栖类支原体迄今测出的最小的基因组科学家最近测出的两个细菌基因组如此之简单和小，它们也许给自身的定位带来危机。日本和西班牙的研究小组测定了生活在其它生物内的“共生菌"细菌基因组，其中一个可能将丧失它作为真正生物体的地位而成为其宿主细胞的一个部分，另一个看来正在走向灭绝。Carsonellaruddii是生活在吸食植物液昆虫身上的一种寄生细菌，它的基因组只有160个kb之长。过去的估计曾把最小的基因组定在400kb左右。虽然Carsonella基因组排得很满，有许多重叠的基因，而且几乎没有“废物”DNA，但是它没有许多被认为是生命不可缺少的基因。这些发

5、现提出，Carsonella也许进化成了昆虫细胞内的一个细胞器，宿主细胞补偿了缺失的基因功能。Buchneraaphidicola的基因组要大一点儿，约为420kb。该细菌与其它几种细菌一样共生在一种蚜虫身上。与其它共生物种相比，B.aphidicola失去了许多能让它为宿主生存作出贡献的重要功能，这是好的共生体所需要做到的。其它的共生细菌看起来接管了这些功能。推测B.aphidicola可能在走向灭绝。电泳鉴定DNA分子的大小原理带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠化学惰性的介质（琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形

6、状的差异，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。凝胶电泳分离生物大分子Agarosegelelectrophoresis迁移率电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快DNA分子大小的估计核酸构型凝胶电泳的分辨率：与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨率在0.2～50Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨率在1～1000bp之间琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。琼脂糖凝胶电泳

7、的参数：缓冲液：TAE（TBE、TPE），1x凝胶的浓度：根据检测的DNA大小，1%DNA样品：<1μg，指示剂电泳条件：大片段低电压长时间，小片段高电压短时间染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在302nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到0.05μg的微量DNA；荧光强度与DNA的片段大小成正比。SeparationRangeVs.%Agarose凝胶中DNA分子的可视化