细胞ROS测定试剂盒说明书1

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1、GENMEDSCIENTIFICSINC.U.S.AGMS10111.1v.AGENMED细胞内氧化应激活性氧（ROS）红色荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED细胞内氧化应激活性氧（ROS）红色荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氢溴化乙啶，在细胞氧化条件下，产生红色荧光，来定量检测细胞内活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。技术背景-超氧自由基阴离子（superoxideradical；O2）、过氧化

2、氢（hydrogenperoxide；H2O2）、羟自由基（hydroxylradical）、单线态氧气（singletoxygen）等细胞内活性氧族（ReactiveOxygenSpecies；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。二氢溴化乙啶（Dihydroethidiumbromide；Hydroethidine；DHE）是一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不外漏的染色剂。一旦被超氧自由基阴离子氧化，二氢溴化乙啶转化为溴化乙啶，进入细胞核，与DNA紧密结合，便产生荧光。据此测定细胞内活性氧族的浓度。产品内容GENMED清理液（ReagentA）毫升GENMED染色液

3、（ReagentB）微升GENMED稀释液（ReagentC）毫升GENMED保存液（ReagentD）毫升产品说明书1份保存方式保存GENMED染色液（ReagentB）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证12月用户自备胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞操作所需的培养基15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器血细胞计数仪：用于细胞计数台式离心机：用于沉淀细胞细胞流式仪：用于细胞荧光分析（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光细胞1实验步骤一、间接法实验开始前，将

4、－20℃冰箱里的试剂盒中的GENMED染色液（ReagentB）置入冰槽里融化，GENMED稀释液（ReagentC）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出微升GENMED染色液（ReagentB）到新的1.5毫升离心管，加入微升GENMED稀释液（ReagentC），混匀后，标记为GENMED染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。21．准备1瓶25cm细胞培养瓶的待测细胞2．小心抽去细胞培养液3．加入毫升GENMED清理液（ReagentA）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面4．小心抽去GENMED清理液（ReagentA）5．加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面

5、6．置入37℃培养箱1分种7．振动培养瓶，使细胞脱落8．加入4毫升用户自备的完全细胞培养液9．移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）10．移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数611．移出1X10细胞到新的15毫升锥形离心管12．放入台式离心机离心5分钟，速度为300g13．小心抽去上清液14．加入毫升含有GENMED染色液（ReagentB）和GENMED稀释液（ReagentC）的GENMED染色工作液，轻柔混匀15．放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照16．放入台式离心机离心5分钟，速度为300g17．小心抽去上清液18．加入预冷的微升GENME

6、D保存液（ReagentD），轻柔混匀细胞颗粒群19．放进冰槽里20．选择下列方式之一进行操作：a)即刻进行细胞流式仪分析：波长540nm氩离子激光，观察50000个细胞以上――波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高b)或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片2）激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高c)或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色杯2）加入微升GENMED保存液（ReagentD）3）上下倾倒混匀数次4）放进荧光分光光度仪：激发波长54

7、0nm，散发波长590nm――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高2二、直接法实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的GENMED染色液（ReagentB）置入冰槽里融化，GENMED稀释液（ReagentC）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出微升GENMED染色液（ReagentB）到新的1.5毫升离心管，加入微升GENMED稀释液（ReagentC），混匀后，标记为GENMED染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。1．准