仪器分析第三章高效液相色谱分析

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1、第三章高效液相色谱分析HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC2021/7/29§3-1高效液相色谱法的特点高效液相色谱法：一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、高灵敏度检测器。2021/7/292021/7/291.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高压：HPLC采用高压输液设备,150-350*105Pa高速：HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成

2、一次分析需时数小时。高效：化学键和固定相,>30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）2021/7/292、HPLC与GC的区别分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。

3、它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。2021/7/29§3-2高效液相色谱法理论基础速率理论P69=2ldp+CdDmu+CmdP2CSmdP2Csdf2DmDmDs++uH=A++CuBu由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：2021/7/29速率方程：H=A+B/u+Cu（1）液体的扩散系数仅为气体的万分之一，HPLC中速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略

4、不计，（2）影响柱效的主要因素是传质项。2021/7/292、提高柱效的途径：提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择薄壳形担体）选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流动相粘度;减小粒度是最有效的途径.2021/7/29§3-3高效液相色谱法主要类型及分离原理1、液液分配色谱法2、液固吸附色谱法3、离子交换色谱法4、离子对色谱5、空间排阻色谱法2021/7/291、液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；分离机制：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流

5、动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用;目前应用最广的固定相:化学键合固定相2021/7/29正相色谱与反相色谱比较正相色谱——固定液极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性<流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分反相色谱：固定相：C-18柱流动相：甲醇-水或乙腈-水2021/7/292、液-固吸附色谱基本原理：组分在固定相吸附剂上

6、的吸附与解吸；固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾；2021/7/293、离子对色谱（分离有机酸、有机碱）原理：流动相中加入离子对试剂，使被测组分的溶质离子与其电荷相反的对离子形成中性离子对，以改善分离分析酸（阴离子分离）：常采用烷基铵类，如：氢氧化四丁基铵分析碱（阳离子分离）：常采用烷基磺酸类，如：己烷磺酸钠；反相离子对色谱：固定相：非极性的疏水键和相(C-18柱)流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈-水2021/7/294、离子交

7、换色谱固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；不同组分与离子交换剂之间亲和力的大小不同。应用：在溶液中可电离的物质，氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。2021/7/295、空间排阻色谱固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以进入到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按

8、质量分离2021/7/29§3-4液相色谱固定相1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。现采用10μm以下的小颗粒（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低；需要高灵敏度的检测器。现在5~10μm全多孔型担体使用广泛2021/7/29化学键合固定相定义：用化