克隆基因表达及基因干扰-修

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1、克隆基因的表达及基因干扰北京协和医院检验科吴洁1克隆基因的表达及基因干扰第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术2克隆基因的表达及基因干扰第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术3第一节外源基因的表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。基因表达4外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。第一节外源基因的表达克隆基因表达5第一节外源基因的表达一、原核生物表

2、达体系二、真核生物表达体系酵母，哺乳动物细胞大肠杆菌6一、原核生物表达体系（二）原核表达载体具有的特点（四）包涵体（一）对外源目的基因的要求（三）真核生物基因在原核细胞中的表达7（一）对外源目的基因的要求1、不应具有5´端非编码区以及内含子结构2、不能直接用真核基因组DNA.3、常以cDNA为模板，设计引物，PCR扩增目的基因.一、原核生物表达体系8选择标志启动子：乳糖启动子lac，色氨酸启动子trp等翻译调控序列，如核糖体结合位点(SD序列)，及翻译起始点和终止序列多克隆位点(MCS)（二）原核表达载体具有的特点一、原核生物表达体系原核启

3、动子SD序列MCS终止子9原核启动子大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致序列：-35box和-10box（Pribnowbox）TTGACA10consensussequences11核糖体结合位点（ribosomebindingsite,RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。SDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译12（三）真核生物基因在原核细胞中的表达1.非融合型表达蛋白2.融合型表达蛋白3.分泌型表

4、达蛋白一、原核生物表达体系131.非融合型表达蛋白载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原等方面基本一致缺点：易被细菌蛋白酶破坏（三）真核生物基因在原核细胞中的表达一、原核生物表达体系SD序列ATG-外源基因-TAG14常用的非融合型表达蛋白原核表达载体pKK223-3抗氨苄青霉素基因tac启动子(trp-lac)SD序列AUG起始密码转录终止序列T1和T2一、原核生物表达体系152.融合型表达蛋白表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的

5、。优点：具有抗原性可作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。便于融合蛋白的分离和纯化。一、原核生物表达体系16融合型表达系统主要有GST系统His系统金黄色葡萄球菌蛋白A系统β-半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统一、原核生物表达体系17①启动子：tac②操纵基因：lacP③调节基因：lacI④S-D序列⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）GST系统----pGEX系列1、载体组成结构:lacItaclacOS-D/ATGGST插入位点TGAlacP18GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱

6、分离纯化。GST系统----pGEX系列2、产物提纯:3、产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用＋19His-tag（组氨酸标签）：在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（6×His）His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被咪唑（或EDTA溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。His系统20213.分泌型表达蛋白载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞外。一、原核生物表达体系pINIII系

7、列载体pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位点22（四）包涵体(inclusionbody)一、原核生物表达体系大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、不溶性和无活性的蛋白质颗粒。23（四）包涵体(inclusionbody)1.包涵体的形成2.包涵体的分离与纯化3.包涵体的复性一、原核生物表达体系241.包涵体的形成表达产率过高，超出细菌蛋白水解能力，产物积聚，与目的蛋白中含硫氨基酸含量呈正相关。原核表达体系缺乏翻译后修饰酶类和辅助因子，中间

8、产物易大量积聚。发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点25有利于目标蛋白的富集，使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必