分子克隆工具酶1

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1、第一篇　基因操作原理A.用于核酸操作的工具酶B.用于基因克隆的载体C.用于基因转移的受体菌或细胞用于核酸操作的工具酶有哪些？体外重组DNA技术所需的基本条件？第二章分子克隆工具酶EnzymesUsedinMolecularCloning在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。在体外对DNA进行分离纯化、连接重组或者修饰合成等，都会涉及一系列酶促反应。用于基因工程的工具酶种类繁多，根据其功能可粗略分为限制酶、连接酶、聚合酶和修饰酶4类。基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶

2、等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。本章要求[掌握]1．限制性内切酶和甲基化酶的种类及性质；2．聚合酶、连接酶、核酸酶的工作特性。限制性核酸内切酶的概

3、念及其分类，同裂酶、同尾酶、限制性核酸内切酶星活性的概念；Ⅱ型限制性核酸内切酶命名原则。[熟悉]1．生物的限制与修饰现象。2．复制、转录等生物学现象。3．酶的动力学特性。产生星活性的原因、影响其酶活性的因素[了解]1.琼脂糖酶、蛋白酶等其他酶的生物学功能；2.Klenow酶、T4DNA连接酶、碱性磷酸酶、核酸酶的基本性质及用途。限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于

4、DNA和RNA的末端修饰其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。第一节限制性内切酶restrictionednonuclease限制性内切酶的发现限制性内切酶的分类限制性内切酶的命名限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用限制与修饰现象图解噬菌体侵染细菌噬菌体侵染细菌仍有少量phageλ(K)可在E.coliB中生存，是因为E.coliBphage对λ(K)进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)修饰的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（

5、修饰作用）指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶（restrictionednonuclease）的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主范围受到限制。限制（Restriction）指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶（methylase）的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。修饰（Modification）1968年，MeselsonandYuan从E.coli菌株Ｋ和Ｂ中发

6、现了Ⅰ型限制酶；1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindⅠ和HindⅢ迄今已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。一、限制酶的命名与分类1、命名1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts

7、在此基础上进行了系统分类①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)，正体。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示，正体写在第4个字母之后，字母间无间隔。例：EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠEcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。限制性核酸内切酶的命名原则：属名种名株名

8、Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株HindⅡHindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶2、分类据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ