实时荧光定量PCR介绍

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1、September14,2021实时荧光定量PCR介绍宝生物工程（大连）有限公司主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析GMO定量检测差异显示结果验证基因芯片结果验证siRNA效果

2、确认mRNA表达量分析病毒及病原菌检测物种鉴定基因分型绝对定量相对定量RealTimePCR的原理激发光发射光使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。RealTimePCRCt值RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI荧光染料嵌合法荧光探针法RealTimePCR的检测方法荧光染料嵌合

3、法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenIPrimer退火FFFFSYBRGreenI法作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer热变性FFFFTaqMan法作用机理TaqMan探针为一寡核苷酸，5’端标记一个报告基团（Reporter），3’端标记一个淬灭基团（Quencher）。RQRQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变性退火延伸TaqManProbe法原理示

4、意图One-StepRT-PCR特异性高多重PCR检出Probe设计要求高Probe法Probe合成费用高SYBRGreenI法与Probe法比较常用于mRNA表达量分析等SYBRGreenI法简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌检测主要内容2RealTimePCR实验方法反转录反应RealTimePCR反应RTPrimer的选择RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificP

5、rimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以内适用，RT效率较高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不适用于复数基因的检出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。OligodTPrimer5’3’RFAAA

6、···目的片段Random适用于mRNA表达量分析，提升反应检测的灵敏度。RTPrimer的选择RealTimePCR引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同=>对引物设计要求严格普通PCR引物RealTimePCR引物两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)★GC含量Primer长度80-150bp(尽量限制在

7、300bp以内)★扩增片段大小★17-25base使用BLAST检索，确认引物特异性★★★特异性△引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列△引物3’末端避免2base以上的互补序列★★★互补性3’末端序列△整体上碱基不能过偏△个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)△避免T/C连续，A/G连续★序列★△3’末端避免GCrich或ATrich△3’末端碱基最好为G或C△3’末端碱基尽量避免为T尽量在Exonjunction上设计引物，限制基因组DNA扩增★★★RT-PCR用引物RealTime

8、PCR引物设计原则探针的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe长度探针5’末端的第一个碱基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相对较高的区域设计△整体上碱基不能过偏△个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)；避免T/C连续，A/C连续★序列Probe内部或Probe与两条引物之间避免3base以上的互补序列★★★互补