Western_Blot_技术

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1、WesternBlot技术概述Westernblot的中文名称是：蛋白质印迹。是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的三种印迹技术之一（其他两种是Southernblot——DNA印迹和Northernblot——RNA印迹，且均为验证试验中的金指标）。目前公认的该实验技术的发明人为美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化学》（AnalyticalBiochemistry）中首次被称为WesternBlot。原理WesternBlot与Southern印记杂交或Northern杂交方法类似，但W

2、esternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维膜-NC膜，PVDF膜等）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。分类WesternBlot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFi

3、v.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。基本方法蛋白质的制备蛋白的提取：倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。按1ml裂解液加10lPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要

4、摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）每瓶细胞加400l含PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。蛋白质的测量：使用标准试剂盒，按照说明书操作蛋白质样本的固定：使用标准试剂盒，按照说明书操作。（固定时蛋白质总浓度应当保证至上样时达到50g/孔）SDS-PAGE电泳配胶：玻璃板对齐后放入夹中卡紧

5、。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板

6、流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）上样：加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品（Marker：5-10l；样本：20l）。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外

7、槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。电泳采用恒压得方法：1.恒压80V，至样本跑过浓缩胶；2.将电压调至120V至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，准备进行进行转膜。转膜转膜现有两种方法：A.半干转：采用恒流的方法，按照1mA/cm2计算总电流量，时间约为25-60min。（本法多使用NC膜）B.湿转法：采用恒流的方法，横流150mA，1-2小时。（本法多使用PVDF膜，本法会产生大量的热量，且对温度敏感度较高，需用大量冰块降温）转一张膜需准备6张滤纸和1张转印