不同微生物对不同矿物作用下EPS生成差异研究

《不同微生物对不同矿物作用下EPS生成差异研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、不同微生物对不同矿物作用下EPS生成差异研究一、研究目的：探讨在不同矿物与不同微生物相互作用下，微生物EPS生成种类与产生量的差异。二、实验材料：1、微生物：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胶质芽胞杆菌、酵母菌、黑曲霉2、培养基：培养基1：牛肉膏0.5g；蛋白胨1g；氯化钠0.5g；琼脂2g；蒸馏水100mL；pH7.0～7.2；灭菌1.05kg/cm2，30min。（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌适用）培养基2：葡萄糖10g；KH2PO40.2g；MgSO4·7H2O0.2g；NaCl0.2g；CaSO4·2H2O5g；CaCO30.1g；蒸馏水1000ml，pH7.0～7

2、.2，105℃灭菌30min。（胶质芽胞杆菌适用）培养基3：葡萄糖20g；蛋白胨5g；酵母膏5g；pH7.0～7.2，105℃灭菌30min。（酵母菌适用）培养基4：马铃薯200g；蔗糖（或葡萄糖）20g；水1000ml，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml。105℃灭菌30min。矿物：方解石、蒙脱石、长石（钠、钾）、石英；PM2.5大气颗粒物矿物前处理：超细粉碎到2.5um以下颗粒（分级处理？）。三、实验方案：1、液相培养体系250mL三角瓶中100mL液体培养基加入小于2.5um的矿物颗粒物，在

3、30℃培养箱中静止培养。按加入颗粒物的量探讨在不同矿物浓度条件下诱导和刺激EPS生成情况。不接矿物为对照2、固相培养体系加入15mL相对应的固体培养基在培养皿中，矿物颗粒物加到固体培养基中（以灭菌后的矿物颗粒物均匀的涂布在培养基表层），然后接种细菌，30℃培养箱中培养，按不同的作用时间提取菌苔与矿物进行分析。不接矿物为对照四、样品分析对作用后产物固体或液体进行分析。1、EPS提取：首先经过3000rpm离心15min,然后再用100mmol/LNaCI溶液洗涤两次，之后将菌苔重新悬浮至一定体积，并转移至提取容器中，放入玻璃珠若干，在超声仪中超声2min，随之置于摇

4、床上150rpm水平振荡10min，再重新超声2min，随后溶液经过12000rpm离心15min，得到的上清液经过0.45um醋酸纤维素膜过滤，就为提取EPS溶液，然后进行化学成分分析。2、扫描电镜生物样品的制备方法:1）取矿物与细菌经相应培养基培养至对数期后用微孔滤膜(0.25um)过滤或经离心机离心获取。2）表面清洁：用蒸馏水、生理盐水、缓冲液漂洗或冲洗，清除样品表面杂物。3）固定：一般采用戊二醛、锇酸、高锰酸钾等固定液固定。通常进行双重固定，即2%戊二醛(pH6.5)固定2h-4h后，清洗10次，用1%锇酸再固定2h，再用缓冲液洗10次。4）不同浓度的丙酮

5、依次脱水，过程如下:40%，5min，50%，5min，60%，5min，70%，5min，80%，5min，90%，10min，100%，10min，100%，5min，100%，5min。5）置换:先用1:1的丙酮和醋酸异戊酯置换，再用100%醋酸异戊酯置换。6）临界点干燥：经临界点干燥仪进行干燥。7）离子溅射。8）扫描电镜观察并拍照记录。3、透射电镜(TEM)生物样品的制备(超薄切片法)1）取材：离心获取细菌。2）固定：一般采用双重固定，即戊二醛固定1h-3h后，经相应缓冲液清洗，再用1%锇酸后固定1h-2h。3）脱水：一般过程为30%乙醇或丙酮，5min-

6、10min，50%乙醇或丙酮，5min-10min，70%乙醇或丙酮，5min-10min，90%乙醇或丙酮，10min-15min，100%乙醇或丙酮(三次，每次各10min-15min)。4）渗透：包括两步，(1)将样品置于100%脱水剂及等量包埋剂的混合液中(室温、5-8h或过夜);(2)将样品置于纯包埋剂中(室温、5h-8h或过夜)。5）包埋：经过上述的渗透之后，即可进行包埋，常规的包埋是把经渗透后的样品挑入已装有少量包埋剂的胶囊内，或特制的锥形塑料囊，或多孔橡胶模板中，将胶囊灌满包埋剂，放入标签，然后根据包埋剂聚合时所需的温度及时放入温箱聚合，制成包埋块

7、。6）超薄切片：在超薄切片机上将材料切成600Å-900Å的厚度。7）染色：普遍采用双重染色，即先用醋酸铀染色，再用硝酸铅染色。8）透射电镜观察并拍照记录。4、EPS成分分析测定EPS为液体和固体中的含量取培养良好的菌液（总挥发性固体含量VSS约为6g/L）,加入少许NaCl后轻轻搅拌清洗三次,随后60℃水浴加热1h，18000rpm离心20min剥离EPS，经0.22um滤膜过滤后，将滤液置于截留分子量3500Da的透析袋中，密闭后置于盛有蒸馏水的烧杯中4℃透析12h，得到实验所用EPS，于-18℃冰箱保存备用。EPS的蛋白质测定采用考马斯亮蓝比色法，多糖用蒽酮

8、比色法。4