原生质体融合原理技术应用

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1、植物细胞培养植物细胞培养基本原理及主要实验技术生物合成药物历史沿革基本原理主要实验技术01历史沿革1、早期尝试期2、基础研究期营养3、新技术建立时期原生质体融合植物细胞固化质粒转化原生质体体细胞克隆与变异4、植物生物技术期与基因工程结合产业化02基本原理灭菌培养基培养保存021植物材料灭菌前处理、表面灭菌剂、内感染2培养基湿热、过滤3器皿和工具干热、湿热、火焰灼烧4培养室5无菌技术超净工作台100级灭菌02水双蒸水以上无机盐大量微量有机成分碳源蔗糖葡萄糖氨基酸几种常用的有能力合成，但刺激生长产物合成前体多种混合维生素有能力，但不够几种常用的培养基02生长调节剂生长素细胞激动

2、素促进分裂打破顶芽休眠促进茎的分化赤霉素和脱落酸不确定成分混合物其他物质琼脂活性炭去除植物细胞产生的酚类、氧化物、丹宁PH灭菌前5-6培养基02仪器设备常用仪器设备培养器皿和设备实验室设置培养条件温度低于植物生长温度3-4光照用于分化的细胞和光自养型细胞氧培养类型愈伤组织生长迅速疏松非褐化单细胞培养悬浮细胞培养大量培养发酵罐生物反应器植物细胞与微生物比较固定细胞培养特点转化细胞培养培养03主要实验技术愈伤组织培养单细胞培养悬浮细胞培养大量培养固定细胞培养转化细胞培养细胞保存03愈伤组织培养1外植体的选择外植体的来源部位年龄生理状态外植体的大小2培养基的配制培养基的配制大量成

3、分微量成分有机成分铁、激动素按比例混合调酸碱定容分装灭菌定容后加琼脂融化定容培养基的选择外植体培养基生长素激动素四因子3愈伤组织的诱导接种材料的灭菌茎段和叶：蜡质表面活性剂擦种子：一般的采用茎段和叶片的方法根和地下器官无菌操作愈伤组织的培养03单细胞培养1单细胞的分离机械法酶法悬浮培养法愈伤组织在振荡器中培养，过滤得到单细胞2单细胞的培养看护培养：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。铺板培养微室培养03悬浮细胞培养悬浮细胞培养的建立细胞系的建立松散色淡的愈伤组织转入悬浮五代以上培养接种量1/5、1/2、1/10继代培养

4、生长模式封闭系统中S型曲线培养基的选择培养基的特点酸碱缓冲能力差生长素的浓度条件培养低密度培养液中放高密度培养悬浮细胞的透析袋细胞生活力和生长的测定生活力测定荧光素二乙酸酯法、伊万兰染色法细胞生长的测定细胞计数法、干重、鲜重、堆积细胞体积法03大量培养1高产细胞系的筛选颜色目视（紫草素）化学分析（生物碱）2种子的准备逐级继代培养3生物反应器的设计获得产品生物反应器得到细胞发酵罐4培养条件的最适化混合、通气、剪切力、温度、PH5培养系统的操作成批培养、半连续培养、连续培养6测定方法电导率测定、kla测定03固定细胞培养细胞固定在胶体中固定植物细胞在网或泡沫中固定空心纤维膜中固

5、定固定细胞反应器的设计流动床式固定床式03转化细胞培养转化根瘤农杆菌转化细胞的建立叶片悬浮液不要没过诱导愈伤组织转化细胞的培养农杆菌质粒中携带生长素基因转化细胞的分析转化细胞的筛选抗性基因报道基因标记基因外源基因表达产物积累（生物、免疫、化学）03细胞保存冷冻保存冷冻慢冻快冻茎尖保存分部冻茎尖芽悬浮培养慢中间温度30min液氮快干冻真空脱水液氮保藏维持融冰液氮迅速37-40度90s后室温再培养冷藏保存1-9度下仍需继代培养低压保存低氧保存植物细胞中主要生理活性物质和其他化学组分植物细胞技术的优缺点应用实例一二三011.生理活性物质（1）酶类:淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶（2）维生

6、素:辅酶（3）植物激素（4）抗生素和植物杀菌素:蒜，葱，萝卜012.其他成分（后含物）（1）生物碱:罂粟科，茄科（2）糖苷类:洋地黄毒苷（3）挥发油:薄荷油，丁香油（4）有机酸:苹果酸，柠檬酸，水杨酸03工业化产品希腊毛地黄细胞生物转化地高辛日本黄连细胞黄连碱人参根细胞人参皂甙中试水平长春花吲哚生物碱丹参丹参酮青蒿青蒿素红豆杉紫杉醇紫草萘醌三七皂甙021、不受地区、季节、土壤及有害生物的影响2、节约农田3、在无菌条件下完成的,能排除病菌及虫害对药用植物的侵扰;4、研究植物的代谢途径,探索或创造新的合成路线5、人工控制提高代谢物产量优点02(1)生长周期长,易污染。(2)生物

7、反应器的设计装置要求较高。(3)高产细胞株较难获得。缺点03发状根、冠瘿组织细胞培养技术Ő激素自主Ő增殖快>常规细胞Ő次生代谢物含量高、种类广>悬浮培养细胞桔味薄荷冠瘿细胞萜烯洋地黄冠瘿细胞强心甙丹参冠瘿细胞丹参酮长春花冠瘿细胞吲哚生物碱人参发状根培养人参皂甙长春花发状根培养长春碱青蒿发状根培养青蒿素萝芙木发状根培养生物碱03两相培养技术培养体系形成上、下两相,细胞在水相中生长与合成次生物质,然后分泌出来转移到有机相中。减少反馈抑制产量提高有机相循环使用,连续培养,成本降低长春花细胞XAD-7大孔吸附树脂吲哚生物碱